[发明专利]一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种重组大肠杆菌，以大肠杆菌CCTCC NO：M2019390为宿主细胞，表达来源于拟南芥的糖基转移酶基因UGT85A1，获得一株红景天苷的高产菌株E.coli YMGRS。本发明的重组大肠杆菌实现了从头合成红景天苷，底物为葡萄糖，价格低廉，且该菌株在装有2.5L M9Y培养基的5L发酵罐发酵后，红景天苷最高产量为9.3g/L，单位菌体浓度的产量为0.31g/(L·ODsubgt;600/subgt;)，生产强度高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

红景天苷(Salidroside)是红景天中的主要药用成分。临床研究结果表明，红景天苷不但有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射、抗病毒、抗肿瘤等明显功能，而且还具有增强注意力、提高工作效率、延缓机体衰老、防止老年疾病等功效，尤其在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物，近年来备受关注。红景天苷无毒无害，可直接作为天然保健食品或药品，也可添加到焙烤制品、肉制品、面制品、乳制品、果冻、饮料等几乎大部分食品中；红景天苷在化妆品、饲料添加剂方面也有很好的市场前景。因此，红景天苷市场潜力不断扩大，具有很好的市场前景。

目前红景天苷的生产方法是从红景天植物中提取获得。红景天属于高寒多年生草本植物，天然资源有限，并且尚未实现大面积的人工栽培；红景天中红景天苷含量很低，随着开采力度不断加大，导致红景天属植物逐渐枯竭，同时提取法工艺复杂、成本高，并且产物中含有有毒物质百脉根苷。化学合成的方法有文献报道，但未实现工业化。化学合成方法大都存在需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂等缺点,往往残留少量或痕量的其它有毒化学品，具有不安全性，生产成本仍然较高。

目前，已有以大肠杆菌为宿主实现以葡萄糖为原料利用微生物高效发酵合成红景天苷，并且已初步建立了提取工艺。与化学合成法相比，微生物合成红景天苷具有反应条件温和、目标产物可以发酵大量生产的特点，红景天苷主要存在于发酵液中，提取工艺简单；与传统生产方法相比，降低了生产成本和环境污染，实现可持续发展，具有很好的应用前景。但是，现有技术当中红景天苷的产量还有很大的提升空间。因此，价格低廉的生物法合成高产红景天苷成为必然的趋势。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明以E.coliYMGR5A为出发菌构建了一种重组大肠杆菌，提供了一种高效的红景天苷合成方法。

本发明的第一个目的是提供一种生产红景天苷的重组大肠杆菌，以大肠杆菌CCTCC NO：M2019390为宿主细胞，表达来源于拟南芥的糖基转移酶基因UGT85A1(GenBank登录号：At1g22400)。本发明的大肠杆菌CCTCC NO：M2019390已记载于公开号为CN110452865A的中国专利中，命名为E.coliYMGR5A。

进一步地，重组大肠杆菌可以pEtac、pTrc99a、pKK223-3、pLac03等为表达载体，发明人首先采用与构建重组质粒pKK223-3-UGT85A1相同的引物和构建方法，以pEtac为表达载体构建重组质粒pEtac-UGT85A1(抗性标记为卡那霉素抗性)，并进一步获得重组大肠杆菌E.coli YMGR5A/pEtac-UGT85A1，并利用大量其他表达载体构建，最终发现，以pKK223-3为表达载体构建的重组菌的红景天苷产量显著高于其他菌。

进一步地，糖基转移酶基因UGT85A1(GenBank登录号：At1g22400)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：