[发明专利]一种金黄色葡萄球菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种金黄色葡萄球菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点是指在金黄色葡萄球菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括MNP‑1～MNP‑15的标记位点；所述引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定金黄色葡萄球菌并精细的区分不同的小种；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏、高精准和免培养的检测优势，可应用于大规模样本的金黄色葡萄球菌的鉴定和遗传变异检测，对金黄色葡萄球菌的科研和卫生监测均具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种金黄色葡萄球菌的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物，常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、痈、化脓疮口中，空气、污水等环境中也无处不在。金黄色葡萄球菌在适当的条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，金黄色葡萄球菌成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。另外，金黄葡萄球菌也是实验室进行研究常用的模式病原微生物。其作为群体生物，在和宿主、环境的互作中，群体内个体会发生变异，导致检测方法或治疗方法的失效；对于实验室的研究来说，这种不易被察觉的变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌株实际上并不相同，导致实验结果的不可重现和不可比较。人Hella细胞实验室间的异质性已经导致大量的实验结果的不可比较和数据浪费。因此，开发快速、准确的、可监测变异的金黄葡萄球菌检测分析方法对于金黄葡萄球菌的科学研究和应用都具有重要意义。

经典的金黄色葡萄球菌检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序等，在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组和宏基因组测序带来的大量数据浪费和背景噪音，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异的优势。现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的等位基因多样性。

因此，开发金黄色葡萄球菌的高多态性的新型分子标记及免培养的检测技术，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种金黄色葡萄球菌特异的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对金黄色葡萄球菌进行定性的鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

在本发明的第一方面，提供了一种金黄色葡萄球菌的MNP标记位点，所述MNP标记位点是指在金黄色葡萄球菌基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括金黄色葡萄球菌参考序列上MNP-1～MNP-15的标记位点。

上述技术方案中，MNP-1～MNP-15的标记位点具体如说明书表1所示，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括15对引物，具体的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30所示。

上述技术方案中，每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。