[发明专利]一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法

说明书

本发明公开了一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其中包括体外显微操作中：第二极体或前原核取出操作、第二极体或前原核的融入操作等过程，其特征是所述取出操作在第二极体排出后短时间内进行，连同第二极体下一团胞浆一起取出。然后，将相连两胞体置于含有胞膜柔化成分的胞浆机械脱离液中，对其中一块胞体采取胞浆机械脱离操作，以去除该胞体及其中的核物质。植入操作中用显微管将剩下的胞体从原纺锤体蛋白端吸入，将胞体一端浸泡灭活仙台病毒液滴后，压迫在受体卵子胞膜上，并维持一定时间，以促进融合。完全融合数小时后，将凸起的原纺锤体蛋白及其邻近的卵胞浆吸取弃之，实现第二次降残留线粒体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种第二极体或前原核核质置换方法。

背景技术

目前，公知的第二极体或前原核核质置换技术，显微操作步骤中包括：第二极体或前原核取出操作、第二极体或前原核的融入操作等过程，但这两个操作之间的间隔时间一般超过4小时，以使得第二极体与前原核之间充分分离。然而，脱离卵子后的含核胞体(第二极体或含前原核胞体)失去了卵子的大量胞浆保护，独立存在这么长的时间，是否引发其核DNA损伤尚没有研究报道。我们对此进行了研究，发现极体排出后随时间增加而逐渐出现DNA损伤，尤其是4小时后在有些第二极体DNA损伤明显；取出的含前原核胞体也有相似的变化，只是时间稍微延缓了约1小时。这就使得现有报道的第二极体或前原核核质置换技术存在遗传损伤的风险。另外，目前第二极体或前原核核质置换技术，存在随带的残留胞浆(含残留线粒体)虽然较少，但仍然有残留线粒体占比变化(又称“漂变”)，有时会出现扩增，导致突变线粒体超过阈值比例而致病的风险(可简称“漂变风险”)，如果能对目前第二极体或前原核核质置换技术进一步大幅度甚至数量级降低该残留线粒体，则将达到更理想的降漂变风险目的。

发明内容

我们在核质置换操作研究中发现，如果在极体排出后尽早进行核质置换，且将胞体融入位点下的胞浆再次局部吸除，可以大幅度(甚至数量级)地降低随带的残留线粒体DNA，从而实现避免DNA损伤且第二次降线粒体残留(相对核移植时第一次的降残留)的目的。因此，我们提出了二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，以达到该技术在遗传上及“漂变”上的安全性。

本发明提供一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征是所述方法包括：

(1)在体外显微操作中进行第二极体或前原核取出操作，所述取出操作在第二极体排出后0.1-2h内进行，取出时连同第二极体下部胞浆(此时含有前原核)一起取出，获得相连的两块胞体，即第二极体和含前原核胞体，所述两胞体间有尚未消失的原纺锤体蛋白连接；

(2)对其中一块胞体采取胞浆机械脱离操作，以去除该胞体及其中的核物质；

(3)植入操作，用显微管将步骤(2)操作后剩余的胞体从原纺锤体蛋白端吸入，将胞体一端浸泡灭活仙台病毒液后，压迫在受体卵子胞膜上，并维持一定时间，以促进融合，完全融合后原纺锤体蛋白仍然凸起在融入点处；

(4)完全融合数小时后，将该凸起的原纺锤体蛋白及其与之邻近的卵胞浆吸取弃除。

优选的，步骤(1)所述取出操作在第二极体排出后0.5-1h内进行。

更优选的，第二极体排出时间观察可通过延时培养箱进行培养和动态观测。

进一步优选的，步骤(4)中完全融合1-4小时后，将凸起的原纺锤体蛋白及其与之邻近的卵胞浆吸取弃除。

进一步优选的，步骤(2)中所述对其中一块胞体采取胞浆机械脱离操作可以脱除的是含前原核胞体，也可以是第二极体。

本发明提供一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征在于，包含以下步骤：

A.取受精后刚排出第二极体0.1-2h的卵子，在第二极体附近作透明带打孔，显微玻璃管从透明带开口进入；