[发明专利]一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法

权利要求书

1.一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征是所述方法包括：

(1)在体外显微操作中进行第二极体或前原核取出操作，所述取出操作在第二极体排出后0.1-2h内进行，取出时连同第二极体下部胞浆一起取出，获得相连的两块胞体，即第二极体和含前原核胞体，所述两胞体间有尚未消失的原纺锤体蛋白连接；

(2)对其中一块胞体采取胞浆机械脱离操作，以去除该胞体及其中的核物质；

(3)植入操作，用显微管将步骤(2)操作后剩余的胞体从原纺锤体蛋白端吸入，将胞体一端浸泡灭活仙台病毒液后，压迫在受体卵子胞膜上，并维持一定时间，以促进融合，完全融合后原纺锤体蛋白仍然凸起在融入点处；

(4)完全融合数小时后，将该凸起的原纺锤体蛋白及其与之邻近的卵胞浆吸取弃除。

2.根据权利要求1所述的一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征在于，步骤(1)所述取出操作在第二极体排出后0.5-1h内进行。

3.根据权利要求1或2所述的一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征在于，第二极体排出时间观察通过延时培养箱进行培养和动态观测。

4.根据权利要求1所述的一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征在于，步骤(4)中完全融合1-4小时后，将凸起的原纺锤体蛋白及其与之邻近的卵胞浆吸取弃除。

5.根据权利要求1所述的一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征在于，步骤(2)中所述对其中一块胞体采取胞浆机械脱离操作可以脱除的是含前原核胞体，也可以是第二极体。

6.根据权利要求1所述的一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征在于，包含以下步骤：

A.取受精后刚排出第二极体0.1-2h的卵子，在第二极体附近作透明带打孔，显微玻璃管从透明带开口进入；

B.显微玻璃管从透明带开口进入吸出第二极体并连带第二极体下的部分胞浆的胞体，其中一卵(受体卵)取出胞体后弃之，对另一卵(供核卵)取出的胞体继续操作；

C.将步骤B所得两相连胞体置入胞浆机械脱离用培养液，用显微玻璃管吸入其中一个胞体，露出另一侧胞体，并使得两胞体交界处位于管口附近，使得原纺锤体蛋白有部分在管内有部分露出在管外，将玻璃管相对皿底晃动，或者将露出部分靠近液滴边沿向与矿物油的交接界面挤压；

D.经上述C操作，由于胞浆机械脱离用培养液使得胞体的胞膜变得柔软且粘滞，易被机械力作用下逐渐拉伸变细，并在断开后重新自行闭合，不会造成胞体膜破裂崩解；

E.经上述操作，使得一侧相连胞体脱除，将剩余胞体用显微管从其原纺锤体蛋白的一端吸入；

F.带到灭活仙台病毒液滴中，吐露出一部分浸泡数十秒；

G.经受体卵的透明带开口，将浸泡过灭活仙台病毒液滴的胞体部分吐露出管外，压迫在卵子膜上，维持数十秒至数分钟，待胞膜间粘合较牢固后，轻轻吐露出胞体并后撤出吸管；

H.再经数分钟或数十分钟后，卵子与胞体完全融合，雌核逐渐往卵中部移动，而原纺锤体蛋白依然凸起在融合位点处；

I.约数小时后，从原纺锤体蛋白凸起处吸入其邻近部分的卵胞浆；

J.弃除步骤I中吸入的胞浆，以实现进一步大幅度降低残留线粒体的目的。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的一种二次降低残留线粒体的第二极体或前原核核质置换方法，其特征在于，进行第二极体或前原核取出操作的为小鼠卵子或人卵子等哺乳动物卵子。