[发明专利]利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法

说明书

本发明公开了利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导‑三维血管生成模型的方法，属于动物细胞培养技术领域。所述方法，包括：体外培养条件下，以猪血管内皮细胞作为猪胎盘血管内皮细胞模型，添加细胞微载体珠，低氧诱导并孵育使细胞微载体珠包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；再将包被载体珠与基质胶混合，低氧诱导并孵育，使所述基质胶包埋所述包被载体珠，形成构建猪血管内皮细胞的缺氧诱导‑三维血管生成模型。本发明的三维模型模拟猪胎盘血管内皮细胞的体内生长环境，研究低氧条件下猪内皮细胞迁移和成管。同时还能观察单个细胞行为特征比如出芽的过程，这为更加深入的探索胎盘血管生成出芽、迁移和成管等生物学过程提供方向和方法。

技术领域

本发明涉及动物细胞培养技术领域，特别是涉及一种利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法。

背景技术

母猪胎盘血管发育对于胎儿发育至关重要，母猪胎盘血管发育不良所导致的胎儿营养供应不足以及缺氧等问题,会造成胎儿死亡或者胎儿弱小并降低仔猪泌乳期存活率。胎儿在妊娠后期迅速生长，因此会导致在空间有限的子宫变得拥挤缺氧，胎儿快速生长发育对于营养物质和氧气的大量需求也会导致血管中氧气供应不足，使得血管内皮细胞处于低氧状态。因此,我们认为母猪胎盘血管生成是在一个低氧的环境中发生的。血管生成是指从现有的血管中生成新的血管。血管生成是一个多阶段的过程包括活化的内皮细胞降解基底膜，从母血管中出芽，迁移、增殖、排列、成管，最终从邻近血管生成分支并与之接合。尽管目前已经掌握了研究血管生成表型-迁移和成管的技术手段，但是还不能精确区分内皮细胞具体的行为特征表型以及具有不同特征功能的功能细胞(尖端细胞和茎细胞)。

尽管人和猪在种属上有明显的差异，但是哺乳动物血管内皮细胞在成管过程中的表型和关键基因存在很大的共性。需要建立新的体外技术方法来研究低氧条件下猪血管内皮细胞的血管生成。

发明内容

本发明的目的是提供利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法，以解决上述现有技术存在的问题，利用低氧模块化培养箱和三维血管生成模型，为细胞培养创造稳定可控的低氧环境和三维出芽环境，为模拟猪胎盘血管生成提供新的体外细胞模型和研究方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法，包括以下步骤：

体外培养条件下，以猪血管内皮细胞作为猪胎盘血管内皮细胞模型，添加细胞微载体珠，低氧诱导并孵育使细胞微载体珠包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；

再将包被载体珠与基质胶混合，低氧诱导并孵育，使所述基质胶包埋所述包被载体珠，形成构建猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型。

优选的是，体外培养还包括利用猪血管内皮细胞传代培养，具体包括以下步骤：将猪血管内皮细胞接种到细胞生长培养基中，于37℃、5％CO₂的条件下培养3-5d，在培养至细胞密度为80-90％时，用胰酶消化，然后再进行传代培养，当细胞生长至汇合度为70％-80％时进行传代，2-3d传代一次。

优选的是，猪血管内皮细胞传代培养3-4代时，加入细胞微载体珠、基质胶，低氧诱导0-24h，检测细胞株微载体珠上诱导猪血管内皮细胞出芽、迁移以及成管情况。

优选的是，细胞微载体珠的制备方法包括：

在PBS中水化和膨胀的干珠，在摇床上室温处理3h以上，形成微载体珠；

将所得微载体珠静置15min以上，弃去上清液，再用PBS冲洗后，加入新鲜的PBS制备成3000珠/mL的储备液；

将所得储备液高温灭菌消毒，得到细胞微载体珠。

优选的是，所述细胞生长培养基为含有体积浓度为10％的胎牛血清、1％的青霉素-链霉素混合溶液的RPMI培养基。