[发明专利]利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法

权利要求书

1.一种利用猪血管内皮细胞建立缺氧诱导-三维血管生成模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

体外培养条件下，以猪血管内皮细胞作为猪胎盘血管内皮细胞模型，添加细胞微载体珠，低氧诱导并孵育使细胞微载体珠包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；

再将包被载体珠与基质胶混合，低氧诱导并孵育，使所述基质胶包埋所述包被载体珠，形成构建猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，体外培养还包括利用猪血管内皮细胞传代培养，具体包括以下步骤：将猪血管内皮细胞接种到细胞生长培养基中，于37℃、5％CO₂的条件下培养3-5d，在培养至细胞密度为80-90％时，用胰酶消化，然后再进行传代培养，当细胞生长至汇合度为70％-80％时进行传代，2-3d传代一次。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，猪血管内皮细胞传代培养3-4代时，加入细胞微载体珠、基质胶，低氧诱导0-24h，检测细胞株微载体珠上诱导猪血管内皮细胞出芽、迁移以及成管情况。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，细胞微载体珠的制备方法包括：

在PBS中水化和膨胀的干珠，在摇床上室温处理3h以上，形成微载体珠；

将所得微载体珠静置15min以上，弃去上清液，再用PBS冲洗后，加入新鲜的PBS制备成3000珠/mL的储备液；

将所得储备液高温灭菌消毒，得到细胞微载体珠。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞生长培养基为含有体积浓度为10％的胎牛血清、1％的青霉素-链霉素混合溶液的RPMI培养基。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，低氧诱导时所用的低氧诱导培养基为：含有体积浓度为10％的胎牛血清、20ng/mL血管内皮生长因子、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1％的青霉素-链霉素混合溶液的RPMI培养基。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，按照1×10⁶个猪血管内皮细胞活细胞与80-85μL细胞微载体的配比混合孵育，以使细胞微载体包裹猪血管内皮细胞，形成包被载体珠；

按照包被载体珠：基质胶的体积比为50：60-150混合孵育，以用基质胶包埋所述包被载体珠。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法构建的猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型。

9.如权利要求8所述的猪血管内皮细胞的缺氧诱导-三维血管生成模型在检测和筛选影响血管生成药物中的用途。