[发明专利]提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用

说明书

本发明提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过敲除Aokap1基因可以提高米曲霉曲酸产量，这对于构建米曲霉曲酸高产菌株提供了新靶点和新途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用。

背景技术

曲酸，化学名称为5-羟基-2-羟甲基-1，4-吡喃酮，是一种由微生物发酵产生的有机酸，广泛存在于酒类、酱油及豆瓣酱等酿造产品中。由于具有抑菌功效、抗氧化活性、螯合金属离子和抑制酪氨酸酶活性等性质，曲酸常用作抗菌剂、防腐剂、保鲜剂和美白剂等，被广泛应用在医药、农业、食品和化妆品等各个产业。目前，国内外曲酸的生产主要通过米曲霉菌株发酵而成。由于直接从自然界获得的米曲霉菌株产生的曲酸产量并不高，通常需要对菌株进行诱变处理，之后通过筛选得到曲酸高产菌株，但目前研究表明利用诱变提高米曲霉曲酸产量的效果已明显降低，不能满足日益增长的曲酸市场需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用。

为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了特异性靶向基因Aokap1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了含有上述sgRNA的CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体。

本发明还提供了提高米曲霉曲酸产量的方法，通过敲除基因Aokap1实现。

优选地，上述方法包括将CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。

优选地，上述方法包括以下步骤：

1)以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物扩增U6启动子，获得PU6-Aokap1片段；

2)以sgRNA和U6终止子序列为模板，将Aokap1靶基因的靶向序列作为引物接头，PCR扩增获得Aokap1-sgRNA-TU6，从而将Aokap1靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端，获得Aokap1-sgRNA-TU6片段；

3)将PU6-Aokap1和Aokap1-sgRNA-TU6进行重叠PCR，获得含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒PU6-Aokap1-sgRNA-TU6；

4)将线性化的CRISPR-Cas9载体与PU6-Aokap1-sgRNA-TU6重组连接获得pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体；

5)利用原生质体转化法将pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。

更优选地，步骤1)中，正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物分别为：

PU6-F：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA；

PU6-Aokap1-R：CGGTGGGCCTGATTGTAGGTGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；

步骤2)中，

TU6-Aokap1-F：CACCTACAATCAGGCCCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；