[发明专利]提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用

权利要求书

1.提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.特异性靶向权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.含有权利要求2所述的sgRNA的CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体。

4.提高米曲霉曲酸产量的方法，通过敲除权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1实现。

5.根据权利要求4所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，包括将CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。

6.根据权利要求4所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物扩增U6启动子，获得PU6-Aokap1片段；

2)以sgRNA和U6终止子序列为模板，将Aokap1靶基因的靶向序列作为引物接头，PCR扩增获得Aokap1-sgRNA-TU6，从而将Aokap1靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端，获得Aokap1-sgRNA-TU6片段；

3)将PU6-Aokap1和Aokap1-sgRNA-TU6进行重叠PCR，获得含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒PU6-Aokap1-sgRNA-TU6；

4)将线性化的CRISPR-Cas9载体与PU6-Aokap1-sgRNA-TU6重组连接获得pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体；

5)利用原生质体转化法将pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。

7.根据权利要求6所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，步骤1)中，正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物分别为：

PU6-F：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA；

PU6-Aokap1-R：CGGTGGGCCTGATTGTAGGTGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；

步骤2)中，

TU6-Aokap1-F：CACCTACAATCAGGCCCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；

TU6-R：AATTCGAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG。

8.根据权利要求6所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，还包括利用KODDNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，测序分析突变情况，从而获得Aokap1敲除菌株。

9.根据权利要求8所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，以CRISPR-S-Aokap1-F/R为引物，利用KOD DNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，其中：

CRISPR-S-Aokap1-F：GGCTTCAACAGTTCTCCCGA；

CRISPR-S-Aokap1-R：CTTGGTCACGAAGCAGGAGT。

10.权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1在制备米曲霉Aokap1敲除菌株中的应用。