[发明专利]一种改造恶臭假单胞菌使其同化D-半乳糖的方法

说明书

本发明涉及一种改造恶臭假单胞菌使其同化D‑半乳糖的方法，通过在恶臭假单胞菌中导入外源半乳糖酸转运模块和代谢模块，并结合适应性实验室进化，使得恶臭假单胞菌能够高效同化代谢D‑半乳糖。基于该策略，获得了一株可以以D‑半乳糖为唯一碳源快速生长的重组恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZF21，已于2021年09月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M20211155。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改造恶臭假单胞菌使其同化D-半乳糖的方法。

背景技术

全球绝大多数燃料和化学品都是以石油为原料生产的。然而，石油是一种有限的资源，为了人类的可持续发展和未来，以可再生的资源为原料合成生物燃料和生物基化学品是目前的研究热点。其中，生物质资源是储量最大、最具潜力的可持续替代资源。比如，陆地来源的木质纤维素经过预处理可以得到多种单糖，包括D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖等；海洋藻类生物质如石花菜、鸡毛菜等红藻富含D-半乳糖和D-葡萄糖等。将植物生物质中富含的糖类通过微生物发酵转化为商品燃料和化学品是实现绿色可持续发展的重要途径。目前，该过程仍然面临许多挑战。其中一个瓶颈就是很多重要的工业微生物缺乏对D-葡萄糖以外的其他糖类底物的利用能力。

恶臭假单胞菌ATCC 47054(即Pseudomonas putida KT2440)是近年来引起研究者广泛兴趣的一种新的合成生物学底盘，该菌株对预处理后生物质水解液中的胁迫因子(有机酸类、呋喃类、酚类等化合物)有很高的耐受性和转化能力。但是，该菌株不能以D-葡萄糖以外的其他生物质来源单糖为唯一碳源生长，极大地限制了其在生物炼制领域的应用。本发明旨在提出一种新型改造策略，赋予恶臭假单胞菌高效D-半乳糖同化能力。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明提供一种改造恶臭假单胞菌使其同化D-半乳糖的方法，以实现恶臭假单胞菌对D-半乳糖的高效利用，拓宽恶臭假单胞菌生物质糖利用底物谱。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明提出了一种改造恶臭假单胞菌使其同化D-半乳糖的方法，通过导入外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块至恶臭假单胞菌中，构建重组恶臭假单胞菌，其中，所述半乳糖酸转运模块为能够编码将半乳糖酸由细胞周质转运至细胞质的蛋白质的序列，所述半乳糖酸代谢模块为能够编码将细胞质中的半乳糖酸转化为中心代谢途径中的丙酮酸和甘油醛-3-磷酸的蛋白质的序列。

其中，所述外源半乳糖酸转运和代谢模块的来源菌株可以是任何包含相应模块的细菌，如霍氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)等，优选地，所述霍氏假单胞菌的半乳糖酸转运模块的序列为SEQ ID NO.3所示，所述霍氏假单胞菌的半乳糖酸代谢模块的序列如SEQ ID NO.4所示；所述大肠杆菌为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，其半乳糖酸转运模块的序列为SEQID NO.1，半乳糖酸代谢模块的序列为SEQ ID NO.2。

具体地，导入外源半乳糖酸转运和代谢模块的方法为如下方法中的任意一种：

(1)将外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块置于不同的质粒上并转化至恶臭假单胞菌中，这两个重组质粒满足在恶臭假单胞菌中自我复制并相容；

(2)将外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块置于同一个质粒上并转化至恶臭假单胞菌中，该重组质粒满足在恶臭假单胞菌中自我复制；

或者(3)将外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块全部整合至恶臭假单胞菌基因组，使其与基因组同步复制。