[发明专利]一种改造恶臭假单胞菌使其同化D-半乳糖的方法

权利要求书

1.一种改造恶臭假单胞菌使其同化D-半乳糖的方法，其特征在于，通过导入外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块至恶臭假单胞菌ATCC 47054中，构建重组恶臭假单胞菌，其中，所述半乳糖酸转运模块为能够编码将半乳糖酸由细胞周质转运至细胞质的蛋白质的序列，所述半乳糖酸代谢模块为能够编码将细胞质中的半乳糖酸转化为中心代谢途径中的丙酮酸和甘油醛-3-磷酸的蛋白质的序列；所述外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块的来源菌株为霍氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiae）、大肠杆菌（Escherichia coli）中的任意一种；所述霍氏假单胞菌为保藏号为CCTCC NO: M2021356的霍氏假单胞菌，其中，所述霍氏假单胞菌的半乳糖酸转运模块的序列为SEQ ID NO.3所示，所述霍氏假单胞菌的半乳糖酸代谢模块的序列如SEQ ID NO.4所示；所述大肠杆菌为大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)，其半乳糖酸转运模块的序列为SEQ ID NO.1，半乳糖酸代谢模块的序列为SEQ IDNO.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，导入外源半乳糖酸转运和代谢模块的方法为如下方法中的任意一种：

（1）将外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块分别置于两个不同的质粒上，然后转化至恶臭假单胞菌中，这两个重组质粒满足在恶臭假单胞菌中自我复制并相容；

（2）将外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块置于同一个质粒上并转化至恶臭假单胞菌中，该重组质粒满足在恶臭假单胞菌中自我复制；

（3）将外源的半乳糖酸转运模块和代谢模块全部整合至恶臭假单胞菌的基因组，与基因组同步复制。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将得到的重组 恶臭假单胞菌进行实验室适应性进化的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述实验室适应性进化包括如下步骤：

（1）挑取LB培养基固体斜面培养的重组恶臭假单胞菌细胞1~2环，接种在装有灭菌的液体LB培养基的容器中进行培养，透气封口膜扎口，置于摇床上，在25-35℃条件下，以200±10 r/min的转速培养10±2 h，得所述菌株的种子液体培养物；

（2）将步骤（1）得到的种子液体培养物按照0.5~5 v/v%的接种量接种在装有灭菌的进化培养基的培养瓶中进行培养，透气封口膜扎口，置于摇床上，在25~35℃条件下，以100~400 r/min的转速培养至细胞OD达0.4~0.8，得所述菌株的第一代细胞培养物；

（3）将步骤（2）所得的第一代细胞培养物离心，转接至新鲜进化培养基，培养基配方与（2）相同，操作方法与步骤与（2）一致，得到所述菌株的第二代细胞培养物；

（4）不断重复步骤（3），得到所述菌株的第10~30代细胞培养物；

（5）当细胞生长周期稳定，停止传代。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述进化培养基配方为：1 L蒸馏水中含：D-半乳糖 1~10 g、Na₂HPO₄ 1~5 g、KH₂PO₄ 1~3 g、NH₄Cl 0.1~1g、NaCl 0.1~1 g、MgSO₄ 0.1~0.4 g、2~3 mL的微量元素溶液、50 mg卡那霉素；所述微量元素溶液配方为：1 L蒸馏水中含：H₃BO₃ 0.1~0.5 g、ZnCl₂ 0.01~0.1 g、MnCl₂·4H₂O 0.01~0.05 g、CoCl₂ 0.1~0.5 g、CuCl₂·2H₂O 0.01~0.5 g、NiCl₂·6H₂O 0.01~0.1g、NaMoO₄·2H₂O 0.01~0.05 g。