[发明专利]一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法及应用

权利要求书

1.一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、根据转录本序列使用特定的DNA模板作为标准品；

步骤二、根据标准品序列进行特异性扩增引物的序列设计；

步骤三、根据待分析植物品种选择合适的内参基因，合成其扩增引物对；

步骤四、提取植物总RNA并进行逆转录反应获得cDNA，使用上述引物对配制反应体系，进行实时荧光定量PCR扩增；

步骤五、根据标准品扩增CT值和浓度绘制标准曲线，计算不同转录本的拷贝数，进行检测结果的分析。

2.根据权利要求1所述的一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法及应用，其特征在于：所述步骤一中特定的DNA选取为杨树DNA，所述杨树DNA为Potri.003G058400，使用杨树不同处理下根组织的cDNA作为模板。

3.根据权利要求1所述的一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法及应用，其特征在于：所述步骤四中植物总RNA的提取质量为260/280在1.9-2.0。

根据权利要求1所述的一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法及应用，其特征在于：所述步骤三中扩增引物对中可变剪接的特异性上下游扩增引物对包括：

转录本1：AS1-F：TTACGAAGTACCGCACACCG，即SEQ ID NO.1；AS1-R：TTGTGAACGAGTTTCAGCCT，即SEQ ID NO.2；

转录本2：AS2-F：CGCGATTCGAAGCCCTATGA，即SEQ ID NO.3；AS2-R：GCTTGCTTATACGCAGCTTTCA，即SEQ ID NO4；

转录本3：AS3-F：TGGTTCATGCAAGGTCCATCA，即SEQ ID NO.5；AS3-R：CACCCTTCTCTAGTCGTGCC，即SEQ ID NO.6。

4.根据权利要求1所述的一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法及应用，其特征在于：所述步骤三中内参基因的上下游扩增引物对包括：RG-F：GATTACCCGGAGAAGCCACC，即SEQ ID NO.7；RG-R：GTTGTGTGGTGCTGTCATCT，即SEQ ID NO.8。

5.根据权利要求1所述的一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法及应用，其特征在于：所述步骤四中反应体系包括：所述扩增引物对、cDNA、ROX Reference Dye、2×SYBRGreen Pro Taq HS Premix和RNase free water。

6.根据权利要求1所述的一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法及应用，其特征在于：所述步骤四中实时荧光定量PCR的扩增条件包括：

Step1：95℃30sec；

Step2：40个循环(两步法：95℃5sec，60℃30sec，荧光信号于60℃处收集)(三步法：95℃5sec，60℃30sec，72℃30sec，荧光信号于72℃处收集)；

Step3：95℃15sec；60℃1min；95℃15sec(每0.3℃收集一次荧光信号)。

7.根据权利要求1-6所述的一种植物可变剪接的实时荧光定量PCR检测方法在检测植物基因多转录本和可变剪接事件的应用。