[发明专利]Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途

说明书

本发明公开了一种Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途。Stk11基因敲除细胞系的构建方法，包括以下步骤：1）根据小鼠Stk11基因全长序列和pLent‑U6‑GFP‑Puro载体的信息设计并合成含有Mlu I及BamH I酶切位点的靶向Stk11的引物序列；2）Stk11干扰质粒（简称pLent‑U6‑shStk11）的构建及其慢病毒制取：3）Stk11基因敲除的C2C12细胞系构建：用制取的pLent‑U6‑shStk11慢病毒载体转染小C2C12成肌细胞，通过嘌呤霉素筛选获得稳定敲除Stk11基因的C2C12细胞系。所述的Stk11基因敲除的细胞系的用途，用于研究敲除Stk11对成肌细胞融合、分化、肌纤维发育及相关基因表达与调控机制，用于药物筛选和制备。本发明适合于开展更多和Stk11基因功能相关的实验，可用于药物筛选和制备，应用前景广泛。

技术领域

本发明涉及一种Stk11 (serine/threonine kinase 11)基因敲除细胞系的构建方法和用途，属于现代农业和医学研究领域的应用技术。

背景技术

Stk11（又叫Lkb1）在哺乳动物多种组织中广泛表达，在骨骼肌组织中表达量较高。Stk11基因突变与多种肿瘤的发生相关，因此被认为是抑癌基因。Stk11基因编码的蛋白质是重要的蛋白激酶，在体内发挥多种生理功能，参与调控肌肉发育、脂肪生成、细胞生长、能量代谢和肿瘤发生发展等。

Stk11基因可能与肌内脂肪沉积、肌细胞分化和融合及肌纤维形成相关，但目前关于Stk11基因调控肌纤维发育和肌内脂质代谢的机制鲜见报道，也未有Stk11基因敲除的相关细胞系。比如通过敲除动物模型研究，体外细胞实验每次需要分离原代肌卫星细胞，繁琐周期长、不易操作，成功率低。

因此，构建Stk11基因敲除的成肌（myoblast）细胞系并研究其在调控肌细胞的增殖、分化和融合及肌内脂肪沉积等过程中的功能具有重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途。

一种Stk11基因敲除细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1）根据小鼠Stk11基因全长序列和pLent-U6-GFP-Puro载体的信息设计并合成含有Mlu I及BamH I酶切位点的靶向Stk11的引物序列；正义寡核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；

反义寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

2）Stk11干扰质粒（简称pLent-U6-shStk11）的构建及其慢病毒制取：将1）Stk11的shRNA引物退火反应形成互补双链，然后将退火产物用Mlu I和BamH I双酶切，再与双酶切后的pLent-U6质粒连接，构建Stk11干扰质粒（pLent-U6-shStk11），转化大肠杆菌，并挑选单克隆菌PCR和测序鉴定；将阳性克隆菌质粒提取后，采用脂质体转染法将12μg pLent-U6-shStk11和9 µg pSPAX.2及3.5 µg pMD2.G共转染到293T细胞中，48h后获得pLent-U6-shStk11慢病毒载体；

3）Stk11基因敲除的C2C12细胞系构建：用制取的pLent-U6-shStk11慢病毒载体转染小C2C12成肌细胞，通过嘌呤霉素筛选获得稳定敲除Stk11基因的C2C12细胞系。

步骤2）所得的pLent-U6-shStk11慢病毒载体进行鉴定：

转染密度为70%~80%的293T细胞，48 h后用收集细胞，提取总蛋白并用Westernblot 法检测目的蛋白Stk11和内参GAPDH蛋白表达情况。

一种根据所述的构建方法得到的Stk11基因敲除细胞系。

一种根据所述的Stk11基因敲除的细胞系的用途，用于研究敲除Stk11对成肌细胞融合、分化、肌纤维发育及相关基因表达与调控机制，用于药物筛选和制备。