[发明专利]Stk11基因敲除细胞系及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种Stk11基因敲除细胞系的构建方法，其特征是：包括以下步骤：

1）根据小鼠Stk11基因全长序列和pLent-U6-GFP-Puro载体的信息设计并合成含有MluI及BamH I酶切位点的靶向Stk11的引物序列；正义寡核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反义寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

2）Stk11干扰质粒（简称pLent-U6-shStk11）的构建及其慢病毒制取：将1）Stk11的shRNA引物退火反应形成互补双链，然后将退火产物用Mlu I和BamH I双酶切，再与双酶切后的pLent-U6质粒连接，构建Stk11干扰质粒（pLent-U6-shStk11），转化大肠杆菌，并挑选单克隆菌PCR和测序鉴定；将阳性克隆菌质粒提取后，采用脂质体转染法将12μg pLent-U6-shStk11和9 µg pSPAX.2及3.5 µg pMD2.G共转染到293T细胞中，48h后获得pLent-U6-shStk11慢病毒载体；

3）Stk11基因敲除的C2C12细胞系构建：用制取的pLent-U6-shStk11慢病毒载体转染小C2C12成肌细胞，通过嘌呤霉素筛选获得稳定敲除Stk11基因的C2C12细胞系。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是：步骤2）所得的pLent-U6-shStk11慢病毒载体进行鉴定：

转染密度为70%~80%的293T细胞，48 h后用收集细胞，提取总蛋白并用Western blot法检测目的蛋白Stk11和内参GAPDH蛋白表达情况。

3.一种根据权利要求1所述的构建方法得到的Stk11基因敲除细胞系。

4.一种根据权利要求3所述的Stk11基因敲除的细胞系的用途，其特征是：用于研究敲除Stk11对成肌细胞融合、分化、肌纤维发育及相关基因表达与调控机制，用于药物筛选和制备。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征是：Stk11基因敲除下调细胞中肌细胞融合基因。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征是：Stk11基因敲除下调细胞中MyHC的表达量。