[发明专利]一种烤烟蚜传病毒多重复合PCR的检测方法

说明书

本发明属于植物病毒学检测技术领域，具体涉及一种烤烟蚜传病毒多重复合PCR的检测方法，包括以下几个步骤：(1)设计用于扩增黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)2种病毒基因片段的特异性引物；(2)提取样本总RNA；(3)含病毒RNA的烟草植物总RNA样品高温变性作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；(4)利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；(5)将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。本检测体系通过一次PCR反应，就可以鉴定出复合侵染的多种病毒，适合基层检测站点快速和高效地鉴定大批量烟叶样品，为后续的被侵染烟株的提早发现和抗病毒遗传育种等病毒防控工作打下了基础。

技术领域

本发明属于检测技术领域，进一步属于植物病毒学检测技术领域，具体涉及一种烤烟蚜传病毒多重复合PCR的检测方法。

背景技术

马铃薯Y病毒(PVY)引起的病害又称烟草脉带病、烟草脉斑病毒病。由于病毒株系不同而表现出不同症状。主要有脉带花叶型、脉斑型和褪绿斑点型。脉带型在烟株上部叶片呈黄绿花叶斑驳，脉间色浅，叶脉两侧深绿，形成明显的脉带，严重时出现卷叶或灼斑，叶片成熟不正常，色泽不均，品质下降，烟株矮化。脉斑型下部叶片发病，叶片黄褐，主侧脉从叶基开始呈灰黑或红褐色坏死，叶柄脆，摘下可见维管束变褐，茎秆上现红褐或黑色坏死条纹。褪绿斑点型初期与脉带型相似，但上部叶片现褪绿斑点，后中下部叶产生褐色或白色小坏死斑，病斑不规则，严重时整叶斑点密集，形成穿孔或脱落。马铃薯Y病毒病烟株发病初期出现明脉，不久形成花叶型的斑驳，随后小叶脉间颜色变淡,叶脉两侧的组织呈深绿色带状。受坏死株系侵染的病株，叶脉呈褐色至黑色坏死。

黄瓜花叶病毒(CMV)是一种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的任何部位。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。全世界所有烟草种植区均有该病毒的分布和危害。世界上分布在英国、德国、丹麦、俄罗斯、印度、日本、韩国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、捷克、保加利亚、巴西、爱尔兰、摩尔多厄、瑞典、芬兰、波兰等地区以及我国大部分地区。

这两种病毒都有烟蚜等介体昆虫非持续性传播，传播距离较广，防治方法较有限，对烟叶的品质和产量带来巨大的影响，现有手段都是单独检测其中一种病毒，费事费力，成本高，因此需要一种快速同时检测上述两种病毒的检测手段。

发明内容

为了解决上述检测马铃薯Y病毒(PVY)和黄瓜花叶病毒(CMV)时费时费力成本高的技术问题，本发明提供一种烤烟蚜传病毒多重复合PCR的检测方法。

技术方案如下：

A、设计用于扩增黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)2种病毒基因片段的特异性引物：

CMV：上游引物(CMV_CP_F1)5′-gcagctggtcgtccaactat-3′；

下游引物(CMV_CP_R1)5′-gactgtcacccacacggtag-3′；

PVY：上游引物(PVY_CP_F1)5′-ccagccaaacccgaacaaag-3′；

下游引物(PVY_CP_R1)5′-tactgatgccaccgtccaac-3′；

B、提取样本总RNA；

C、在无RNA酶的PCR管中加入提取的含病毒RNA的烟草植物总RNA样品作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；

D、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；

E、将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

优选地，在步骤A中，利用NCBI平台的引物设计软件(Primer designing tool)对两个黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)的基因组中外壳蛋白，在相同退火温度的条件下，选择覆盖区域长度差异最大的的引物对。