[发明专利]一种烤烟蚜传病毒多重复合PCR的检测方法

权利要求书

1.一种烤烟蚜传病毒多重复合PCR的检测方法，其特征在于，所述的烟草花叶病毒多重复合PCR的检测方法包括以下步骤：

A、设计用于扩增黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)2种病毒基因片段的特异性引物：

CMV：上游引物(CMV_CP_F1)5′-gcagctggtcgtccaactat-3′；

下游引物(CMV_CP_R1)5′-gactgtcacccacacggtag-3′；

PVY：上游引物(PVY_CP_F1)5′-ccagccaaacccgaacaaag-3′；

下游引物(PVY_CP_R1)5′-tactgatgccaccgtccaac-3′；

B、提取样本总RNA；

C、在无RNA酶的PCR管中加入提取的含病毒RNA烟草植物总RNA样品作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；

D、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；

E、将获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤A中，利用NCBI平台的引物设计软件(Primer designing tool)，对黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)的两个基因组中外壳蛋白，在相同退火温度的条件下，选择覆盖区域长度差异最大的的引物对。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤C合成cDNA第一链采用ThermoScientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，反应总体系为25uL；具体步骤：将2uL总RNA和1uL随机六聚体引物用无核酸酶的高纯水补充到17uL后轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却；再加入5X Reaction Buffer4uL、RiboLock RNase Inhibitor酶抑制剂(20U/μL)1uL、10mM dNTP Mix 2μL和RevertAidM-MuLV逆转录酶(200U/μL)1μL，轻轻离心，混匀，25℃孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟，70℃加热5分钟终止反应，保存。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤D中多重PCR扩增反应：PCR反应体系是25uL：包含了cDNA模板1uL，两组上、下游引物(CMV_CP_F1，CMV_CP_R1，PVY_CP_F1，PVY_CP_R1)各10mM，反应酶(Qiagen Multiplex PCR Master Mix)13uL，其余体积为灭菌超纯水；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退30s，72℃延伸30s，循环数为25次；最后72℃延伸7min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤D中多重PCR扩增反应，对黄瓜花叶病毒扩增出240bp的片段，对马铃薯Y病毒扩增出660bp的片段。