[发明专利]获得肽的方法

说明书

本发明涉及用于从原核细胞和/或真核细胞获得肽的方法。所述方法包括以下步骤：a)裂解原核细胞和/或真核细胞并且回收由此获得的蛋白质，b)使用至少一种变性剂使蛋白质变性，c)使用至少一种烷基化剂使变性的蛋白质烷基化，d)使用至少一种蛋白水解酶将在步骤c结束时获得的蛋白质酶促蛋白水解，e)回收在酶促蛋白水解步骤d结束时获得的肽，其中步骤a中所述原核细胞和/或真核细胞的裂解是在低浓度离液剂下的裂解，其中步骤a‑d同时进行，其中在低浓度离液剂下的裂解是通过借助于超声波探头进行的声处理的裂解，其中变性剂是选自三(2‑羧乙基)膦和二硫苏糖醇的硫醇还原剂，且烷基化剂是碘乙酰胺；所述方法在大气压力下进行。

本申请是申请日为2013年05月02日，申请号为201380035027.8，发明名称为“获得肽的方法”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及从原核细胞和/或真核细胞获得肽以用于其随后分析的方法。

这些肽的分析的确可以证明在大量应用中，特别是在生物标记物研究或细菌肽分析中有用，所述应用例如在鉴别、分型、抗性标记物和毒性标记物检测的应用框架内，并且此框架在医学、药学以及农产品领域内。

技术现状

根据现有技术提取并且纯化肽的方案通常非常冗长。此外，这些方法通常手动实施并且复杂。

国际申请WO 2006/031063描述了意图水解多肽的组合物，此水解反应通过使用称为“PCA”的溶液以化学方法获得，所述PCA包括酸(比如纯乙酸)、水易混合的有机溶剂(比如乙腈)和还原剂(比如三(2-羧乙基)膦)。此化学消化在99.9℃下进行两小时。然而，可能为了增加蛋白水解的效率，WO 2006/031063任选地预先采取措施将化学消化这步连接至之前的酶消化步骤。使用经修饰的胰蛋白酶在37℃下进行酶消化步骤12小时，随后热变性步骤(90℃20分钟)。上述化学消化步骤在酶消化这步之后进行(99.9℃2小时)。蛋白质样品的总处理时间因此大于14小时，这表示了无以争辩的主要缺点。此外，WO 2006/031063教导了比常规胰蛋白酶更贵的经修饰的胰蛋白酶的用途。

就其本身而言，国际申请WO 2008/128029公开了蛋白质或肽在溶液中片段化的方法，所述方法包括：在酶消化或化学消化的初始步骤之后，一系列分离和片段化的另外步骤。后者一方面有助于增加片段化方法的总时间，但另一方面需要多种操作，从而致使此方法的自动化极其困难。

专利US 7,622,273描述了意图使经翻译后修饰的多肽或蛋白质变性的方案，这些肽和蛋白质直接结合到蛋白质微阵列，并且所述方案包括化学处理、酶消化或化学消化的步骤以及随后鉴别所述蛋白质微阵列上蛋白质的步骤。化学处理步骤包括所述蛋白质的变性、还原和烷基化，而酶消化步骤包括所述蛋白质的去糖基化和/或去磷酸化以及通过化学蛋白水解或酶蛋白水解的所述蛋白质的消化。所有的反应在蛋白质微阵列上按次序地进行。化学处理步骤持续至少3小时15分并且酶消化步骤持续两小时(参见实例1)，即5小时15分的最小持续时间。尽管这小于常规方法的持续时间—大约24小时—然而仍然不令人满意，特别考虑到临床领域或药学领域中固有的要求。更重要的是，复杂样品(血浆、尿、脑脊液等)在实施此专利公开的方案之前可能需要分级分离策略或消除策略，以使目标蛋白质分离，这因此增加了所述样品的总处理持续时间。