[发明专利]一种植物基因表达载体的构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种植物基因表达载体的构建方法和应用，所述植物基因表达载体的构建方法包括：从植物基因组中分离靶标基因对应的基因序列：根据靶标基因设计聚合酶链式反应引物，进行PCR，即可得到靶标基因对应的基因序列；构建质粒载体：通过引入酶切位点、对质粒进行双酶切处理、电泳、凝胶回收、连接、转化、提取，得到质粒载体；将含有靶标基因对象基因序列连接到构建的质粒载体上，构建含靶标基因的植物表达载体。本发明能够快速的构建基因表达载体，方法简便、成本低廉，成功率高；利用本发明的方法构建的基因表达载体，插入的基因能够在植物体内稳定表达，可用于转基因过程细胞的筛选和观察，有效提高转基因效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种植物基因表达载体的构建方法和应用。

背景技术

目前，植物基因工程技术的迅速发展和广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。该技术克服了植物有性杂交的限制，可将来源于不同物种甚至人工合成的基因导入植物，从而改良植物性状，培育优质高产作物新品种。在基因克隆、基因功能分析以及基因转化等分子生物学的研究与应用过程中，载体构建是常用的技术手段，采用合适的表达载体和构建方法会使实验效果事半功倍。但是，现有的植物基因表达载体表达的基因不稳定，且构建成功率低、连接率不高，同时操作复杂成本昂贵。因此，亟需一种新的物基因表达载体的构建方法，以弥补现有技术中存在的问题及缺陷。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的植物基因表达载体表达的基因不稳定，且构建成功率低、连接率不高，同时操作复杂成本昂贵。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种植物基因表达载体的构建方法和应用。

本发明是这样实现的，一种植物基因表达载体的构建方法，所述植物基因表达载体的构建方法包括以下步骤：

步骤一，从植物基因组中分离靶标基因对应的基因序列：根据靶标基因设计聚合酶链式反应引物，进行聚合酶链式反应即PCR；将DNA模板、设计的引物、聚合酶、dNTP、缓冲液以及MgCl₂进行混合均匀，构成PCR体系；进行预变性和20～30次扩增温度循环，循环结束后，于65℃的条件下补齐并延伸处理15～30min后反应结束；反应结束后，进行靶标基因扩增处理，即可得到靶标基因对应的基因序列，备用；

步骤二，构建质粒载体：在质粒的启动子和终止子之间引入多克隆酶切位点；利用限制性内切酶，对质粒进行双酶切处理；将双酶切后的质粒，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒获得经过切除处理的的质粒；基于引入的酶切位点、限制性内切酶合成DNA片段，将所述DNA片段与已进行切除处理的质粒进行连接；连接后的重组质粒利用热激法转化到大肠杆菌的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有卡那霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经卡那霉素的LB液体培养基扩繁后，利用质粒提取方法提取重组质粒DNA，即可得到质粒载体，备用；

步骤三，将含有靶标基因对象基因序列连接到构建的质粒载体上，构建含靶标基因的植物表达载体：对步骤一构建得到的质粒载体进行双酶切处理，并将酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后分别回收目的基因片段以及酶切载体；将回收的质粒载体与含有靶标基因对象基因序列进行连接，挑取培养平板上生长良好的单菌落，置于含有卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养一段时间；取培养后的菌液进行PCR扩增，将PCR检测呈阳性的菌落克隆在20～30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中进行扩大培养；提取质粒，进行双酶切鉴定，利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即可得到构建好的植物基因表达载体。

进一步，步骤一中，所述缓冲液为T4 DNA连接酶缓冲液，由500mM Tris-HCl，8％的1,3-丙二醇，2.0mM DTT，5～20mMATP组成，pH 8.0。