[发明专利]一种植物基因表达载体的构建方法和应用

权利要求书

1.一种植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，所述植物基因表达载体的构建方法包括以下步骤：

步骤一，从植物基因组中分离靶标基因对应的基因序列：根据靶标基因设计聚合酶链式反应引物，进行聚合酶链式反应即PCR；将DNA模板、设计的引物、聚合酶、dNTP、缓冲液以及MgCl₂混合均匀，构成PCR体系；进行预变性和20～30次扩增温度循环，循环结束后，于72℃的条件下补齐并延伸处理10～15min后反应结束；反应结束后，进行靶标基因扩增处理，即可得到靶标基因对应的基因序列，测序备用；

步骤二，构建质粒载体：在质粒的启动子和终止子之间引入多克隆酶切位点；利用限制性内切酶，对质粒进行双酶切处理；将双酶切后的质粒，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒获得经过切除处理的的质粒；基于引入的酶切位点、限制性内切酶合成DNA片段，将所述DNA片段与已进行切除处理的质粒进行连接；连接后的重组质粒利用热激法转化到大肠杆菌的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有卡那霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经卡那霉素的LB液体培养基扩繁后，利用质粒提取方法提取重组质粒DNA，即可得到质粒载体，备用；

步骤三，将含有靶标基因对象基因序列连接到构建的质粒载体上，构建含靶标基因的植物表达载体：对步骤一构建得到的质粒载体进行双酶切处理，并将酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后分别回收目的基因片段以及酶切载体；将回收的质粒载体与含有靶标基因对象基因序列进行连接，挑取培养平板上生长良好的单菌落，置于含有卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养一段时间；取培养后的菌液进行PCR扩增，将PCR检测呈阳性的菌落克隆在20～30mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中进行扩大培养；提取质粒，进行双酶切鉴定，利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即可得到构建好的植物基因表达载体。

2.如权利要求1所述的植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述缓冲液为T4 DNA连接酶缓冲液，由500mM Tris-HCl，8％的1,3-丙二醇，2.0mM DTT，5～20mMATP组成，pH 8.0。

3.如权利要求1所述的植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述循环的条件为：90℃预变性8～12min，85℃变性60sec，45℃退火25sec，65℃延伸20sec，循环20～30次。

4.如权利要求1所述的植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，步骤二中，利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将所述DNA片段与已进行切除处理的质粒进行连接。

5.如权利要求1所述的植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述卡那霉素浓度为50mg/L。

6.如权利要求1所述的植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述质粒提取方法包括：

(1)将含有目的质粒的大肠杆菌接种培养，得到大肠杆菌培养菌液，进行离心，去除上清液，得到大肠杆菌体沉淀；将大肠杆菌体沉淀加入菌体裂解试剂进行菌体裂解，得到呈半透明状裂解液，室温静置2～3min；

(2)向呈半透明状裂解液中加入杂质去除试剂，充分混合后，高速离心，取上清菌液，备用；

(3)将上清菌液上样层析柱，进行洗脱，收集含有质粒的洗脱液，重复洗脱四次，即可得提取的质粒。

7.如权利要求6所述的植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，所述向呈半透明状裂解液中加入杂质去除试剂包括：按每1mL大肠杆菌培养菌液加入40～60μL杂质去除试剂的比例添加所述杂质去除试剂；其中，所述杂质去除试剂为乙酸﹑氯化钠的混合液。

8.如权利要求6所述的植物基因表达载体的构建方法，其特征在于，所述高速离心的条件为：设置高速离心机的离心速率为3000～4500转/分钟，离心分离时间为10～15min。