[发明专利]一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明的一种诺如病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法，包括诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液，诺如病毒反应液为预分装至八连管中的冻干粉。其中，诺如病毒反应液中含有多条不同荧光标记的探针、引物、酶混合物、增强剂、冻干保护剂、10xbuffer、核苷酸混合物等，可以在同一反应体系中检测是否感染诺如病毒。通过内源性内参对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对诺如病毒在核酸水平上的检测。

技术领域

本发明涉及诺如病毒核酸检测技术领域，尤指一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，NV)是引起肠道急性病症的RNA病毒，根据RNA多聚酶区核苷酸序列的相似性，将NV分为5个基因型(GI～GV)，其中只有GI、GⅡ和GIV可以感染人。诺如病毒已被很多国家认为是导致成人和儿童病毒性腹泻及肠胃炎的首要病原体，以手-粪-口为主，其次是直接接触传染，我国流行的人类诺如病毒主要以基因组Ⅱ为主。感染临床表现为急性胃肠炎和渗透性腹泻病，病程一般为7天，发热持续3天，呕吐2～3天，腹泻5天，严重出现脱水症状。诺如病毒多在寒冷的冬季发病，所以又被称为冬季呕吐症。因为其不能在细胞或组织中培养，对诊断工作带来了一定的困难。

经过检索，中国发明专利：腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用(申请号为201710503230.3，申请日为2017.06.27)，该申请案公开了一种腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用。检测体系共有22对引物，其中包括19对腹泻病原体、2对人基因组内参和1对系统质控内参引物。腹泻病原体分别针对空肠弯曲菌、志贺菌、艰难梭菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、大肠埃希菌O157、弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、人星状病毒、诺如病毒II、人肠道腺病毒、轮状病毒等。可在同一反应体系内直接对粪便样本进行多种腹泻病原体的同步检测和分析，弥补了常规检测方法通量低、耗时长和检出率低等缺点，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学诊断，为个体化用药和精准医疗提供重要参考。但是该申请案针对多种引起腹泻的病原体(包括细菌和病毒)进行检测，所用方法为毛细管电泳，通过引物设计，不同的病原体可扩增不同长度的DNA片段，将扩增产物从PCR仪取出后转移至毛细管电泳分析仪中分析扩增片段长度，不同长度DNA片段电泳速度不同，从而区分不同的病原体。该申请案的不足之处：1.引物设计复杂，引物合成成本较高。2.检测过程耗时较长，需先提取核酸，再PCR扩增，再毛细管电泳分析片段长度进而分析可能感染的病原体。3.如若引物设计不够合理，不同目的基因扩增片段长度相差过小，则会因为电泳中的漂移问题，无法有效判断扩增片段的大小，进而带来检测误差。4.该方法仅包含诺如GⅡ型扩增引物，因此无法检测其他型别的诺如病毒。而目前不管是从临床个性化诊治还是国家疾控传染病监测需要，均需监测并区分常见患者所感染的诺如病毒型别。

发明内容

本发明提供一种诺如病毒核酸检测试剂盒及其使用方法，将针对检测诺如GⅠ型和GⅡ型病毒检测并对其分型鉴定的效率慢、容易产生误差以及成本高的的技术问题。

本发明提供的技术方案如下：一种诺如病毒核酸检测试剂盒，包括诺如病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。

优选地，所述诺如病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xBuffer、增强剂、冻干保护剂、诺如病毒GⅠ上游引物、诺如病毒GⅠ下游引物、诺如病毒GⅠ探针P1、诺如病毒GⅠ探针P2、诺如病毒GⅡ上游引物、诺如病毒GⅡ下游引物、诺如病毒GⅡ探针、内参β-actin上游引物、内参β-actin下游引物和内参β-actin探针。

优选地，所述检测靶标位于诺如病毒GI型的VP1基因，所述检测靶标位于诺如病毒GII型的ORF基因。