[发明专利]检测血液中多种类固醇激素的方法及试剂盒

权利要求书

1.检测血液中多种类固醇激素的方法，其特征在于，采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过前处理的血液中DHEA、DHT、P5、17OHP5；

S1、利用高效液相色谱将DHEA、DHT、P5、17OHP5与干扰物分离；

S2、利用同位素内标法定量；

S3、以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算待测样本中DHEA、DHT、P5、17OHP5的含量。

2.根据权利要求1所述的检测血液中多种类固醇激素的方法，其特征在于，高效液相色谱的具体条件为：

流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；

流动相B：乙腈，纯度为色谱纯；浓度为100％；

色谱柱型号：Waters XBridge BEH C18，3.5μm,2.1mm*150mm；

采用梯度洗脱方式，见表1；

流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为10μl。

表1流动相梯度洗脱参数

3.根据权利要求2所述的检测血液中多种类固醇激素的方法，其特征在于，质谱条件为：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为5500V；碰撞气为8；气帘气为20psi；离子源温度为650℃；离子源气流GS1为70psi；GS2为50psi；目标物DHEAm/z 332.2→253.1，d6-DHEAm/z 338.2→253.1；DHTm/z 334.2→105.1，d3-Tm/z 337.2→105.1；P5m/z 360.2→300.1，d2,¹³C2-P5m/z 364.2→304.1；17OHP5m/z358.2→145.1，d2,¹³C2-17OHP5m/z 362.2→145.1；

5种类固醇激素及内标的去簇电压-DP、射入电压-EP、碰撞电压-CE、碰撞室射出电压-CXP参数见表2。

表2睾酮及内标的质谱参数

4.根据权利要求1所述的检测血液中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述经前处理的血液按照如下方法制备得到：取血液300μl于2ml离心管中，加入混合内标溶液，涡旋震荡1min，13000r/min离心10min，转移所有清液至另一2ml离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入水稍作涡旋，再向其中加入萃取液，涡旋振荡萃取，转移有机相至另一2ml离心管，重复上述操作再萃取一次，合并两次有机相；氮气吹干；

向吹干后的离心管中加入衍生剂，密封避光水浴反应；反应完成后以13000r/min离心5min取上清，进样10μl上机检测。

5.根据权利要求4所述的检测血液中多种类固醇激素的方法，其特征在于，混合内标溶液配制：分别精确称取1mg d6-DHEA、d3-DHT、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5标准品于4个10ml容量瓶，用乙腈溶解定容至刻度，得到100μg/ml d6-DHEA、d3-DHT、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5内标母液；

取10μl 100μg/ml d6-DHEA、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5和1μl 100μg/ml d3-DHT内标母液于10ml容量瓶，用乙腈稀释定容至刻度得100ng/ml d6-DHEA、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5和10ng/ml d3-DHT混合溶液；

取0.25ml所述混合溶液用乙腈稀释定容至100ml得到浓度为0.25ng/ml d6-DHEA、d2,¹³C2-P5、d2,¹³C2-17OHP5和0.025ng/ml d3-DHT实验用混合内标溶液。