[发明专利]一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供具有丙酮酸合成途径的起始菌；

进行步骤S200和S300对所述起始菌的基因组进行改造，构建两步法用基因工程菌株；或者，进行步骤S200、S300和S400，构建过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株；其中，

S200：插入6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝；

S300：插入具有42℃～55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald；

S400：失活或缺失丙氨酸消旋酶基因，再引入过表达的丙氨酸消旋酶基因。

2.如权利要求1所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌还具有乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有乳酸脱氢酶基因；

所述的构建方法还包括如下步骤：

S100：失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。

3.如权利要求2所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，所述起始菌还具有D-乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti；

所述的构建方法还包括如下步骤S500：失活或缺失所述起始菌的基因组中含有的D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti；

优选地，所述D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti的序列如SEQ ID NO.43所示。

4.如权利要求1所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，

所述6-磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ ID NO.41所示，所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQ ID NO.42所示；和/或，

所述丙氨酸脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，在步骤200和步骤300中，插入相关基因的方式为在染色体上增加该基因的拷贝，并在该基因前面串联启动子。

6.如权利要求5所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述启动子为P_als；优选地，所述启动子的序列如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求1所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，

所述步骤S400中，全部失活或全部缺失丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2；和/或，

所述步骤S400中，所述引入过表达的丙氨酸消旋酶基因通过插入强启动子和丙氨酸消旋酶基因实现；插入的丙氨酸消旋酶基因为丙氨酸消旋酶基因alr1或/和丙氨酸消旋酶基因alr2。

8.如权利要求7所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，

所述丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述丙氨酸消旋酶基因alr2的序列SEQ ID NO.3所示；和/或，

所述强启动子的序列SEQ ID NO.4所示。

9.如权利要求2所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100和步骤S200。

10.如权利要求2所述的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200、步骤S300和步骤S400。