[发明专利]一株高效生产碱性果胶酶的重组菌及其应用

说明书

本发明涉及一株高效生产碱性果胶酶的重组菌及其应用，所述重组菌是将枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因的突变体pelA*连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K，并优化信号肽种类(MF4I、HFBI、W1、Albumin和Invertase 2)及伴侣因子(BMH2、HAC1、PDI1和KEX2)，转化至重组表达碱性果胶酶的毕赤酵母中。本发明主要采用信号肽、共表达分子伴侣等策略提高了碱性果胶酶在毕赤酵母中的分泌表达水平。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一株高效生产碱性果胶酶的重组菌及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。

果胶酶的生产菌株有很多，比如曲霉属、青霉属、链霉属、假单孢菌属、芽孢杆菌属以及克雷伯氏菌等。果胶酶应用广泛，已有接近50年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶(alkaline pectinases，APs)，其中APs主要在果汁澄清、茶发酵、纺织加工、植物韧皮纤维脱胶、果胶废水处理以及造纸等方面有着广泛的应用。应用酶法作用上述领域相关反应具有降低能耗、绿色环保、保护纤维、提高精炼效率等优点。已发现的碱性果胶酶的酶活相对较低，无法满足工业应用的要求。然而，目前对APs通过分子改造的研究相对较少，商品化的APs也不足够。

目前表达碱性果胶酶的宿主主要包括大肠杆菌、毕赤酵母和枯草芽孢杆菌。其中，毕赤酵母(Pichiapastoris)营养需求低、增殖速率高、菌体密度大，且毕赤酵母表达蛋白易于纯化，产量高，适合大规模生产。但是异源蛋白过量表达会导致生长胁迫压力引起未折叠蛋白效应(UPR)、或者未折叠蛋白未能进行有效修饰，导致碱性果胶酶的产量不能进一步提高，限制了碱性果胶酶的工业化生产。有关信号肽以及分子伴侣共表达策略提高碱性蛋白酶的研究未见报道。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了提供一株高效表达碱性果胶酶的重组菌株。所述重组菌是将枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因的突变体pelA*连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K，并优化信号肽种类(MF4I、HFBI、W1、Albumin和Invertase2)及伴侣因子(BMH2、HAC1、PDI1和KEX2)，转化至重组表达碱性果胶酶的毕赤酵母中。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种高效生产碱性果胶酶的重组菌的构建方法，包括：

将碱性果胶酶基因的突变体pelA*基因、信号肽基因片段分别连接到表达载体pPIC9K上并进行优化，得到重组质粒Ⅰ；

将伴侣因子基因片段分别连接到表达载体pGAPZA上并进行优化，得到重组质粒Ⅱ；

将重组质粒Ⅰ转化重组表达碱性果胶酶的毕赤酵母中得到分泌增强型基因工程菌株；

重组质粒Ⅱ转化至所述分泌增强型基因工程菌株中，获得碱性果胶酶分泌增强型基因工程菌株。

本发明主要采用信号肽、共表达分子伴侣等策略提高了碱性果胶酶在毕赤酵母中的分泌表达水平。

本发明的第二个方面，提供了上述的方法构建的高效生产碱性果胶酶的重组菌。

本发明的第三个方面，提供了一种高效生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，包括：

将任一上述的重组菌进行发酵培养。

本发明的有益效果在于：