[发明专利]一种用于培养肉种子细胞体外大规模培养的培养基和基因操作方法

说明书

本发明提供一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基以及基因操作方法。改良后的培养基添加有靶向Hippo‑YAP通路的激活剂、抑制剂，其能够在高密度条件下促进肌肉干细胞增殖并维持干性基因表达。基因操作方法指对Hippo‑YAP通路的关键元件进行敲低、敲除、过表达等基因操作，可促进高密条件下肌肉干细胞的增殖和干性维持。改良培养基以及基因操作方法有助于体外大量扩增功能性肌肉干细胞，较好地满足培养肉生产对于种子细胞的大规模需求。

技术领域

本发明属于干细胞和细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种用于解决培养肉种子细胞体外扩大培养过程中接触抑制问题的改良培养基和基因操作方法。

背景技术

随着经济增长和营养结构的改变，全球范围内对肉制品的需求正呈现出前所未有的快速增长趋势，依靠传统养殖业的肉类生产方式正经受着日益严峻的挑战。培养肉是基于细胞工程、组织工程等技术发展起来的一种未来食品生产技术，通过畜禽干细胞分离与扩增，定向成肌分化，食品化加工等流程实现肉类的绿色、安全、可持续生产。和传统生产相比，培养肉生产过程可以显著降低土地和水的使用，减少温室气体排放，同时不受动物疫病冲击。因此，培养肉可以为解决肉品生产和消费困境提供有效方案。

畜禽动物中分离的干细胞是培养肉生产所需的种子细胞。初始分离的畜禽干细胞数量稀少，需要首先在体外对其进行大量扩增，再定向诱导分化产生肌纤维等成熟细胞，进而制备培养肉。

因此如何扩增获得大量有功能的动物干细胞是培养肉研究和产业转化的关键问题。肌肉干细胞是目前最具有潜力、研究最多的一类培养肉种子细胞，其在体内具有修复损伤的肌肉组织以及维持肌肉干细胞库的功能，经分离、纯化后，肌肉干细胞可以在体外进行分裂、增殖，定向分化形成多核肌细胞，并表达肌肉组织特有的肌球蛋白等关键营养成分。

目前公认的体外培养肌肉干细胞的培养基为含有胎牛血清的F10基础培养基，并添加碱性表皮生长因子(basic epidermal growth factor，bFGF)。在此培养条件下，肌肉干细胞培养过程中会发生接触抑制现象，即细胞密度达到一定程度后细胞增殖缓慢、趋于分化，需要进行细胞传代，而传代过程耗时耗力，需要胰酶和终止液等试剂且对细胞存在一定损伤，因此是细胞培养肉产业化的主要限制因素之一。因此，如何解决种子细胞大规模培养中的细胞接触抑制问题，在得到相同数目细胞的情况下减少培养时间和传代次数，一次性收获大量肌肉干细胞，是培养肉研究和产业化应用中亟需解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的是改善肌肉干细胞在体外扩大培养过程中产生的接触抑制问题，提供一种有利于减轻肌肉干细胞体外大规模扩增产生的接触抑制、提高高密度培养条件下细胞增殖速率并维持细胞干性的改良培养基和基因操作方法。

本发明第一方面提供了一种减少细胞接触抑制和/或提高细胞体外增殖速率和/或维持细胞干性的肌肉干细胞体外扩大培养方法，所述方法为抑制肌肉干细胞Hippo通路中的中间酶体基因或激活Hippo通路效应因子；

优选的，所述Hippo通路中的中间酶体基因为MST1、MST2、LATS1或LATS2，所述Hippo通路效应因子为YAP基因。

进一步的，所述方法包括以下步骤：

(1)将肌肉干细胞接种到添加有Hippo通路中间酶体基因抑制剂的细胞生长培养基，或接种到添加有Hippo通路效应因子激活剂的细胞生长培养基，进行两天换液、三天传代培养，获得肌源性细胞；

或，通过基因编辑方法获得抑制Hippo通路中的中间酶体基因表达的肌肉干细胞，或通过基因编辑方法获得过表达Hippo通路效应因子的肌肉干细胞，接种到细胞生长培养基，进行两天换液、三天传代培养，获得肌源性细胞；

(2)将步骤(1)得到的肌源性细胞接种到细胞分化培养皿中，用细胞分化培养基进行诱导分化。