[发明专利]一种用于培养肉种子细胞体外大规模培养的培养基和基因操作方法

权利要求书

1.一种减少细胞接触抑制和/或提高细胞体外增殖速率和/或维持细胞干性的肌肉干细胞体外扩大培养方法，其特征在于，所述方法为抑制肌肉干细胞Hippo通路中的中间酶体基因或激活Hippo通路效应因子，优选的，所述Hippo通路中的中间酶体基因为MST1、MST2、LATS1或LATS2，所述Hippo通路效应因子为YAP基因。

2.根据权利要求1所述的肌肉干细胞体外扩大培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将肌肉干细胞接种到添加有Hippo通路中间酶体基因抑制剂的细胞生长培养基，或接种到添加有Hippo通路效应因子激活剂的细胞生长培养基，进行两天换液、三天传代培养，获得肌源性细胞；

或，通过基因编辑方法获得抑制Hippo通路中的中间酶体基因表达的肌肉干细胞，或通过基因编辑方法获得过表达Hippo通路效应因子的肌肉干细胞，接种到细胞生长培养基，进行两天换液、三天传代培养，获得肌源性细胞；

优选的，步骤(1)所述接种为以低细胞培养密度接种或高细胞培养密度接种，所述低细胞培养密度为2.7*10³/cm²，所述高细胞培养密度为2.2*10⁴/cm²；

(2)将步骤(1)得到的肌源性细胞接种到细胞分化培养皿中，用细胞分化培养基进行诱导分化。

3.根据权利要求2所述的肌肉干细胞体外扩大培养方法，其特征在于，步骤(1)所述细胞生长培养基包括20vol％胎牛血清、79vol％基础培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2；细胞生长培养皿为预涂了0.5mg/ml鼠尾I型胶原的培养皿；

优选的，所述细胞生长培养基包括20vol％胎牛血清、79vol％基础培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及5ng/ml成纤维细胞生长因子2；

优选的，所述细胞生长培养基的基础培养基为DMEM、MEM、DMEM/F12或F10细胞培养基。

4.根据权利要求2所述的肌肉干细胞体外扩大培养方法，其特征在于，步骤(1)所述Hippo通路中间酶体基因抑制剂为XMU-MP-1，所述添加有Hippo通路中间酶体基因抑制剂的细胞生长培养基中，XMU-MP-1的添加量为1-3μM。

5.根据权利要求2所述的肌肉干细胞体外扩大培养方法，其特征在于，步骤(1)所述Hippo通路效应因子激活剂为LPA，所述添加有Hippo通路效应因子激活剂的细胞生长培养基中，LPA添加量为10-25μM。