[发明专利]用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法。该多重PCR引物组合包括：用于特异性扩增杂色曲霉素A脱氢酶基因ver‑1的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物及具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；用于特异性扩增杂色曲霉素B基因verB的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物及具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物；用于特异性扩增真菌ITS序列的引物对。本发明的多重PCR引物组合特异性强、灵敏度高，相互之间不存在干扰。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素是一类主要由曲霉属真菌产生的有毒二次代谢产物，具有极高的致病性和致癌性，黄曲霉和寄生曲霉是常见的黄曲霉素产毒真菌。产黄曲霉毒素的真菌通常在收获、加工、贮藏及运输多环节污染食品及中药材，严重威胁人类健康。

目前对于黄曲霉素的检测主要是通过高效液相色谱法柱后衍生法，该方法能够较为准确的检测黄曲霉素的含量，却存在操作复杂、需要样品量高等缺点。

对黄曲霉素产毒真菌的源头鉴定也是控制黄曲霉素产生的有效手段。一旦食品或中药材被黄曲霉素产毒真菌污染，即存在风险，对源头的准确鉴定是防控黄曲霉素污染的关键。

目前对黄曲霉素产毒真菌的鉴定方法主要是基于菌株形态、生理特征、抗原特异性等特征进行分类鉴别，通常需要经过纯化培养、形态观察、生理生化鉴定等过程，存在检测周期长、操作程序繁琐、专业知识要求高、鉴别水平不够准确等缺点。

近年来，分子生物学手段越来越多的被应用于食源性致病菌的鉴定中。各种PCR技术对于多种真菌的鉴定和检出具有高灵敏度、高特异性、时间周期短等优势。其中，多重PCR是指在同一反应体系中加入两对或两对以上特异引物，对多个模板DNA或者同一个模板DNA的不同区域扩增多个目的片段的反应体系，其具有高效、快速、高通量等优点，目前已经广泛应用于各种真菌和细菌的源头鉴定中，应用效果显著。

但在运用多重PCR进行真菌的源头鉴定时，由于多对引物之间存在竞争性扩增，体系容易出现假阴性、非特异性扩增、灵敏度低等缺点，较单重PCR更难以出现预期结果；因此对引物特异性要求较高。

发明内容

本发明的发明目的是提供快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合和多重PCR试剂盒及检测方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合，包括：

①用于特异性扩增杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1的引物对，该引物对包括具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物，以及具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；

②用于特异性扩增杂色曲霉素B基因verB的引物对，该引物对包括具有如SEQ IDNo.3所示核苷酸序列的上游引物，以及具有如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物；

③用于特异性扩增真菌ITS序列的引物对。

本发明针对杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1、杂色曲霉素B基因verB和真菌ITS序列设计了多重PCR引物，各引物对特异性强、灵敏度高，相互之间不存在干扰。

作为优选，上述的用于快速检测黄曲霉素产毒菌的多重PCR引物组合包括：

①用于特异性扩增杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1的引物对，该引物对包括：

上游引物；5′-GTGACCCCAGAAGTATGAAC-3′；