[发明专利]抑制SOST基因表达的重组质粒及其骨靶向重组腺相关病毒与应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种抑制SOST基因表达的重组质粒及其骨靶向重组腺相关病毒与应用。通过构建一种可以靶向到骨细胞，降低骨细胞Sclerostin（Sost）的表达和分泌的，具有抗骨质疏松作用，给药途径包括肌肉注射、静脉输注，方便应用，为制备治疗或预防骨质疏松症上的应用提供了有力的证据。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及抑制SOST基因表达的重组质粒及其骨靶向重组腺相关病毒与应用。

背景技术

骨质疏松是一种会导致骨量减少、骨密度降低，骨微结构发生改变的全身性骨代谢疾病，骨质疏松根据发病原因可以分为原发性和继发性。继发性一般是由其他疾病或药物引发的骨骼疾病，而原发性是随着年龄的增长必然发生的一种生理衰退型病变，包括绝经性、老年性和特发性三种类型的骨质疏松。绝经后骨质疏松多发生于55岁-65岁中老年女性，而老年性骨质疏松多发生于70岁以上老年人群，特发性骨质疏松多见于青少年和成年，多伴有家族遗传史。骨质疏松的发病率逐年增加，之前的文献报道，全球大约有2亿人患骨质疏松，在中国，绝经女性占总人口的比例约占17％，这意味着患骨质疏松的绝经女性数量将大幅度增加。骨质疏松的主要特点为骨量大量丢失，包括骨矿物质与其基质比例减少；骨微结构由于骨组织形成和吸收失衡导致的退变，表现为骨小梁数量减少，骨小梁变细或发生断裂；骨的脆性增加、骨的力学强度降低，容易发生骨折等。这严重影响正常老年人的生活质量，也给社会的经济带来严重负担。

经典Wnt/β-catenin信号传导通路主要通过激活细胞内的β-catenin活性，使其转移至细胞核内，从而发挥生物学功能。成骨细胞的β-catenin的激活对骨形成至关重要，在小鼠的成骨细胞核骨细胞敲除β-catenin可显著降低松质骨和皮质骨的骨量。但奇怪的是，成骨细胞的细胞数并没有明显上升，而破骨细胞的细胞数却明显增加。破骨细胞的增加的原因认为是β-catenin调控了OPG基因，造成了骨保护素的降低。经典Wnt信号通路主要在细胞膜上通过与低密度脂蛋白供受体家族成员-细胞膜上供受体(LRP5/6)以及F-跨膜卷曲蛋白受体结合，促进糖原合成激酶3β磷酸化，抑制β-catenin退化，进而激活Wnt/β-catenin通路，使β-catenin蛋白因子大量聚集并移向核内，与核内转录因子(TCF/TEF)结合，激活成骨细胞核内下游靶基因cyclin-D1与c-myc从而使成骨细胞增殖加速。可见β-catenin蛋白在骨形成过程中具有重要作用。

Sclerostin是由sost基因编码表达翻译的糖蛋白，在成年以前，发现骨细胞、肝脏细胞、心脏、血管内皮细胞都可以分泌，在成年以后，sost基因主要由骨细胞、软骨细胞表达，分泌于血液中调控外周骨量。之前的研究发现，sclerostin是Wnt信号的特异性抑制因子，可以与细胞表面LRP5/6结合，激活了下游的GSK-3β活性，从而增加β-catenin的磷酸化水平，促进其蛋白降解，从而起到抑制Wnt信号作用。然而，虽然sclerostin目前已被FDA批准上市，但其具有相当程度的心血管风险，所以并未被广泛应用。

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA搞笑特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默，因此其可以特异的将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达降低的作用，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。其中shRNA包括两个短反向重复序列，克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一个颈环(Loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polIII启动子控制，随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”，并被RNAi通道处理。然而由于其打入体内具有一定的肝毒性，所以并未被广泛应用。因此增加组织靶向性将成为未来RNAi体内治疗的优势。