[发明专利]小RNA文库测序过程中去除接头自连产物的方法

说明书

本发明为小RNA文库测序过程中去除接头自连产物的方法，公开了一种去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法。具体而言，提供了一种利用DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链来选择性切割的方法，所述方法包括混合DNA内切酶和所述DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链的步骤：其中，DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链中的酶切位点位于RNA:cDNA配对区，DNA:cDNA双链中的酶切位点位于DNA:cDNA配对区；DNA内切酶可以识别DNA:cDNA双链中的酶切位点并进行切割；任选地，所述DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链产生于RNA测序文库的构建过程中；任选地，所述DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’接头和3’接头。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是基因测序领域。具体地，本发明涉及去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法。更具体地，本发明涉及利用内切酶去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法，基于小RNA样本构建测序文库的方法，构建小RNA测序文库的试剂盒和确定小RNA分子的序列信息的方法。

背景技术

小RNA是生物体内的一大类调控分子，包括miRNA、siRNA、piRNA、snRNA、snoRNA、srRNA等，它们在生物体内发挥着重要的调控作用。近些年已有一些研究成功地将小RNA的谱系作为特定疾病诊断的标志物。未来小RNA的检测将会在疾病的早期诊断、分型和个体化检测治疗中得到广泛地应用。常用的小RNA定量检测技术包括深度测序技术、芯片技术和qRT-PCR技术。后两者需要合成特异性探针，因此只能检测已知种类的小RNA。高通量测序技术因其具有通量高、灵敏度高、无需任何预先的序列信息以及二级结构信息、可以发现新的小RNA分子等优点在小RNA研究领域得到广泛应用。对于小RNA深度测序的文库构建方法主要是两步接头连接反转录法。该方法适用于包括打断的长转录本RNA在内的任何适合连接反应的RNA深度测序文库的构建，例如小RNA测序、CLIP测序、RIP测序、GRO测序等。

小RNA测序由于技术上的限制，现有小RNA或RNA片段的文库构建方法仍较难对微量样品(低于100ng总RNA或1ng小RNA)中的小RNA进行检测。小RNA或RNA片段的文库构建的步骤首先需要在小RNA 3’端连接上3’接头序列，接着在小RNA或RNA片段的5’端连接上5’接头序列。这部分产物经过反转录和PCR扩增就能获得用于深度测序的文库。在连接反应过程中，过量的5’接头和3’接头间会发生连接反应，产生无用的副产物。对于起始量非常低的小RNA或RNA片段的进行连接反应，5’和3’接头间连接产生的副产物占绝大多数，严重阻碍文库的后续PCR扩增。

在目前已有的解决方案中，Trilink公司的CleanTag技术利用在5’接头和3’接头的末端加上特殊修饰，使得接头自连产物无法被逆转录酶有效延伸而去除接头自连污染，而中国科学院上海生命科学研究所的吴立刚等通过Cas9酶切割接头自连产物的方法来去除接头污染，对应测序方法为CAS-seq。这些方法中，CleanTag技术成本高且只能部分去除污染，而CAS-seq技术由于利用了Cas9酶，可能会存在脱靶效应，切割小RNA插入片段，而且成本高，实验操作复杂。

因此，如何简单高效的去除5’和3’接头间连接产生的副产物是实现微量小RNA或RNA片段建库的关键。

发明内容

具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的上述技术问题。

1.一种针对含DNA样本的样本处理方法，所述DNA样本中包含DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链，

所述方法包括在所述DNA样本中加入DNA内切酶，所述DNA内切酶能够有效切割含有其识别位点序列的双链DNA，而对含有所述识别位点序列的RNA:cDNA杂合链具有低活性，

所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链的RNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，所述DNA:cDNA双链的DNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，