[发明专利]小RNA文库测序过程中去除接头自连产物的方法

权利要求书

1.一种针对含DNA样本的样本处理方法，所述DNA样本中包含DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链，

所述方法包括在所述DNA样本中加入DNA内切酶，所述DNA内切酶能够有效切割含有其识别位点序列的双链DNA，而对含有所述识别位点序列的RNA:cDNA杂合链具有低活性，

所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链的RNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，所述DNA:cDNA双链的DNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，

可选地，所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链产生于RNA测序文库的构建过程中；

可选地，DNA:cDNA双链中的DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’端接头和3’端接头形成的自连产物。

2.一种去除RNA测序文库构建时产生的5’接头和3’接头自连产物的方法，或构建RNA测序文库的方法，其包括以下步骤：

(1)在样本RNA分子的3’末端连接所述3’端接头；

(2)在所述连接有3’端接头的样本RNA分子的5’末端连接所述5’端接头；

(3)利用延伸引物，基于所述连接有3’端接头和5’端接头的样本RNA分子，利用延伸酶获得延伸产物；

(4)使用DNA内切酶对所述延伸产物进行酶切处理，去除体系中的所述接头自连产物；

(5)进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库。

其中，所述5’端接头和所述3’端接头均含有所述DNA内切酶的识别位点的部分序列，在形成所述自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列；

可选地，所述样本RNA分子为小RNA分子；优选地，所述小RNA分子的长度为15-200nt；

可选地，所述样本RNA分子的含量为≥50pg；优选地，所述样本RNA分子的量为50pg-20ng。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链的切割效率为对于相应DNA:cDNA双链的切割效率的至多1/10，至多1/100，至多1/1000，至多1/10000，所述DNA:cDNA双链含有相同序列的cDNA以及与其互补的DNA；优选的，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链无活性，或无能够检测到的活性。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(1)的连接反应使用截断型T4 RNA连接酶2作为连接酶。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述3’端接头和所述5’端接头分别带有所述DNA内切酶的识别位点序列30％以上，优选40％以上，更优选50％的序列，且在形成所述自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中使用的延伸酶是逆转录酶或Bst聚合酶。