[发明专利]一种d-核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法

说明书

本发明提供了一种d‑核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法，通过UPLC‑MS分析d‑核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白，确定相应的糖基化肽段，然后对糖基化关键肽段进行ESI‑MS/MS分析，确定糖基化位点，最后用PEAKS Studio软件进行处理，再用PEAKS DB在uniport_homo sapiens数据库中进行搜索，验证糖基化位点。本发明首次通过该方法鉴定出d‑核糖诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点，为糖基化血红素蛋白的结构和功能研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于糖基化位点的分析技术领域，尤其涉及一种d-核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法。

背景技术

糖尿病是最常见的代谢性疾病之一，近年来糖尿病发病率呈上升趋势。这也被称为非酶糖基化。蛋白非酶糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰(PTM)，可导致功能丧失，是糖尿病血管病变的主要发病机制之一。除葡萄糖外，糖尿病患者血液和组织中核糖和果糖含量显著增加，导致α-突触核蛋白、血清和其他细胞蛋白等蛋白发生非酶糖基化。

对于蛋白质的非酶糖基化，研究最深入的是糖化血红蛋白(Hb)。2010-2011年，美国糖尿病协会(ADA)和世界卫生组织(WHO)推荐糖化血红蛋白(葡萄糖和血红蛋白的加合物)作为糖尿病诊断的新标准。同时，人体内不同的碳水化合物和蛋白质可能发生非酶糖基化，导致蛋白质结构和功能的改变。例如，葡萄糖和核糖被发现与Hb发生非酶糖基化。之前已经确定了Hb中葡萄糖的糖基化位点，包括β-V1，α-K16和β-K66的主要位点，以及这两个亚基中的其他Lys残基。此外，Siddiqui等人还发现，核糖体诱导的Hb糖基化导致了二级和三级结构的紊乱。相反，乙酰水杨酸(ASA，阿司匹林)和对硝基苯甲酸(NBA)能够通过赖氨酸残基乙酰化的机制来阻止Hb的糖基化。

相比之下，生物体内其他珠蛋白的非酶糖基化，如肌红蛋白研究较少。其除了具有O₂储运的生物功能，Mb也可能表现出多种生物功能，如作为一氧化氮(NO)清除剂和低氧亚硝酸还原酶(NIR)，以及过氧化物酶激活H₂O₂。Mb主要存在于心肌细胞的细胞质、骨骼和肌肉细胞。当这些细胞受损时，Mb可以迅速进入血液循环，并与葡萄糖等碳水化合物发生非酶糖基化作用，导致蛋白质结构和功能的改变。最近，Grune发现，蛋白酶体更倾向于降解葡萄糖修饰的Mb副作用，如d-核糖与Mb的非酶糖基化。已经证明，核糖通过糖基化引起马心Mb的内部交联。同时，核糖与人Mb(称为HMb)的非酶糖基化还没有报道，HMb的糖基化位点还不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种d-核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法，该方法首次鉴别出d-核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种d-核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法，通过UPLC-MS分析d-核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白，确定相应的糖基化肽段，然后对糖基化肽段进行ESI-MS/MS分析，确定糖基化位点，最后用PEAKS Studio软件进行处理，再用PEAKS DB在uniport_homo sapiens数据库中进行搜索，验证糖基化位点。

优选的，所述d-核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白经胰蛋白酶酶切。

优选的，所述胰蛋白酶与d-核糖诱导的非酶糖基化人肌红蛋白的质量比为40～20:0.5～1.5

优选的，所述胰蛋白酶的酶切条件为36～38℃孵育13～20h。

优选的，所述糖基化肽段为T3、T8、T14和T21四个肽段。