[发明专利]一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽及其检测蛇毒类凝血酶的种属来源、含量的方法与应用

说明书

本发明涉及蛇毒检测技术领域，具体公开一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽及其检测蛇毒类凝血酶的种属来源、含量的方法与应用。所述特征多肽的氨基酸序列为EAYNGLPAK，该特征多肽能够用来检测样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和含量，检测方法为：（1）在待测样品中加入胰蛋白酶进行酶解预处理，取上清液；（2）对所述上清液进行定性离子对和定量离子对检测；（3）若步骤（2）检测得到的色谱图中呈现与对照特征多肽色谱保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品来源于矛头蝮蛇；反之，则为非矛头蝮蛇来源。本发明的这种特征多肽能够在表征样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和含量中发挥重要作用，填补矛头蝮蛇蛇毒质量标准的空白。

技术领域

本发明涉及蝮蛇蛇毒检测技术领域，尤其涉及一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽及其检测蛇毒类凝血酶的种属来源、含量的方法与应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，含有多种蛋白，主要包括金属蛋白酶、磷脂酶A2、神经生长因子、类凝血酶、丝氨酸蛋白酶、L-氨基酸氧化酶等，还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具特点。蛇毒中分子的多样性决定了蛇毒功能的多样性，以蛇毒为原料开发了具有止血、溶栓、降压、止痛和抗肿瘤等不同生物功能一系列药物。其中，蛇毒血凝酶类药物是一类以蛇毒类凝血酶为主要活性成分止血药物，其在止血领域中占据了不可取代的重要地位，占止血药市场份额近50%。

矛头蝮蛇类凝血酶是从矛头蝮蛇（BothropsAtrox）蛇毒中提取的具有止血作用的蛋白酶类物质，具有精氨酸酯酶活性，可在凝血过程中发挥重要作用。在临床上主要用于出血性疾病的治疗，可用于需减少流血或止血的各种医疗情况，如：内科、外科、妇产科、眼科、耳鼻喉科、口腔科等临床科室的出血及出血性疾病；也可用于预防出血，如手术前用药，可避免或减少术中、术后出血；用于消化道出血、血友病血肿、血小板减少性疾病伴出血的辅助治疗，更适用于传统止血药无效的出血患者。目前，已上市蛇毒血凝酶类药物主要来源于矛头蝮蛇、尖吻蝮蛇、蝰蛇和白眉蝮蛇蛇，不同蛇种来源的类凝血酶结构不同，其作用机制不同，相应的药理作用也存在差异，因此建立一种专属性强、灵敏度高的方法来表征其种属来源及含量对于控制蛇毒血凝酶类产品的质量具有广泛的社会效益和经济效应。

发明内容

针对上述的问题，本发明提出一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽及其检测蛇毒类凝血酶种属来源、含量的方法与应用，该特征多肽能够在表征样品中蛇毒类凝血酶的种属来源和检测含量中发挥重要作用，填补矛头蝮蛇蛇毒质量标准的空白。具体地，为实现上述目的，本发明的技术方案如下所示：

在本发明的第一方面，公开一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽，其氨基酸序列为EAYNGLPAK。

在本发明的第二方面，公开一种检测蛇毒类凝血酶的种属来源的方法，采用如下步骤：

（1）在待测样品中加入胰蛋白酶进行酶解预处理，取上清液，备用；

（2）对所述上清液进行定性离子对和定量离子对检测；

（3）若步骤（2）检测得到的色谱图中呈现与对照特征多肽色谱保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品来源于矛头蝮蛇；反之，则为非矛头蝮蛇来源；所述对照特征多肽的氨基酸序列为EAYNGLPAK。

进一步地，步骤（1）中，所述酶解预处理的方法包括：取待测样品用碳酸氢铵溶液溶解并稀释，然后加入胰蛋白酶溶液，适温反应后取上清液，即得。

进一步地，步骤（2）中，将所述上清液分别注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式进行多反应监测。

进一步地，步骤（2）中，以质荷比m/z双电荷481.9→315.2为定量离子对，以481.9→485.2作为定性离子对。