[发明专利]R环的高通量检测方法

说明书

本发明提供了一种R环的高通量检测方法，先使用ddNTP封闭样本中DNA的游离3’‑OH；然后将样本中RNA转化成带biotin修饰的DNA，再进行DNA片段化和末端修复；接头连接；链霉亲和素磁珠富集带biotin修饰的DNA；链特异性文库扩增及测序。本发明提供了一种简便快速的基因组范围检测R环的技术，可以对R环进行高效准确地鉴定，整个流程操作简单、耗时短（不超过4 h）、适用性广、灵敏度和准确性高，适用于R环检测商品试剂盒的开发及应用。

技术领域

本发明专利涉及一种简便快速的R环的高通量检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

R环（R-loop）指的是染色质上的特殊DNA:RNA结构，主要由RNA：DNA双链和游离单链互补DNA组成的三元复合物。DNA甲基化和R环是染色体DNA上的两个重要的状态，对染色质的松散程度、可接近性、染色质之间的相互作用、邻近基因的表达水平具有重要的调控作用，广泛参与到细胞分化、胚胎发育、个体衰老和细胞病变等各种生理和病理过程。因此R环是检测基因表达水平的重要标志物，在肿瘤等疾病检测过程中具有重要的作用。

但是，目前市面上还没有简便快速检测R环的高通量测序产品。已有的方法因为操作复杂、对材料要求严格和假阳性高，一直无法开发成有效的商业化产品。目前已有的R环检测技术包括以下几种：

（1）DRIP-seq系列：这种检测方法主要依赖于特异性识别DNA:RNA杂交链的抗体S9.6对DNA片段进行免疫共沉淀。这种方法存在灵敏度低、操作复杂、耗时长（2天）、特异性和准确性低等缺陷。

（2）基于ChIP-seq技术的R环检测技术：如RChIP，只要依赖于外源过表达的RNaseH突变体对染色质的DNA/RNA区域进行免疫共沉淀，并进行建库。这种方法只能在细胞水平上进行实验，且操作较为繁琐，耗时长（3天），灵敏度低。

（3）基于CUTTag或者CUTRUN技术的R环检测技术：如MapR和Loop CUTTag，这类方法依赖S9.6抗体或者活性缺失的RNase H对R环进行定位，再依赖于转座酶或者核酸内切酶对R环处的DNA进行片段化和标记，再进行建库。这种方法的灵敏度要高于RChIP，但仍然存在耗时长（2天）、灵敏度低、特异性差和操作复杂等问题。此外，这类技术也只能以正常活细胞为起始材料，对样本的要求较高。

综上，目前已有的R环检测技术主要以免疫共沉淀或者免疫标记法进行检测，操作繁琐，耗时长、对样本类型要求高、特异性和准确性差，大大地限制了R环检测技术的普及和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快速的R环的高通量检测方法。

本发明采取的技术方案为：一种R环的高通量检测方法，其特征在于其步骤包括：

（1）提取样本中的DNA，使用ddNTP封闭样本中DNA的游离3’-OH，封闭可以防止DNA上存在断裂区域被延伸插入带生物素biotin的碱基造成的假阳性信号；

（2）使用核糖核酸酶及DNA聚合酶，将样本中RNA转化成带生物素修饰的DNA，该步骤利用RNase H的特异性切割DNA-RNA双链上RNA的特点在R-loop的RNA上产生切口，再使用DNA聚合酶以生物素标记的dUTP为原料进行延伸，将RNA链转化成带生物素标记的dUTP的DNA链，最终变成一条链上含生物素-dUTP的双链DNA；

（3）DNA片段化和末端修复；

（4）接头连接；

（5）链霉亲和素磁珠富集带生物素修饰的DNA；

（6）链特异性文库扩增及测序。

优选的，步骤（2）中采用大肠杆菌DNA聚合酶I以及核糖核酸酶H。

优选的，步骤（2）中对样本中的RNA扩增时使用生物素标记的dUTP。