[发明专利]布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，包括复溶液管和预装检测试剂的扩增检测管、样品采集管、定量吸管、一次性手套以及滴加1μL阳性质粒pMD18‑VirB12的阳性对照膜片、阴性对照膜片，并公开了布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒的使用方法，免去移液器的复杂转液操作和样品核酸提取纯化步骤，真正实现从样品进到结果出的一步扩增，全流程约30分钟，根据A19‑ΔVirB12活疫苗缺失的VirB12基因实现区分疫苗免疫和野毒感染。

技术领域

本发明涉及细菌检测技术领域，具体为布鲁氏菌病疫苗株与野毒株现场快速鉴别诊断试剂盒及使用方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人兽共患传染病，以发热和流产为主要特征，流行于170多个国家和地区，对畜牧业发展和人畜健康构成较大威胁，我国将其列为二类动物疫病。近年来，随着我国家畜饲养量的增加，我国人间和畜间布病发病数均呈快速上升趋势。

布病的防控坚持免疫预防为主的策略，但现有的A19、S2、RB51等弱毒疫苗各有优缺点，且疫苗免疫会干扰后期实验室诊断，无法区分疫苗免疫和野毒感染，给养殖场的布病防控和净化带来很大麻烦，在此形势下新的基因缺失标记疫苗应运而生。由天康生物股份有限公司、新疆畜牧科学院兽医研究所联合研发的新型基因标记疫苗——布鲁氏菌病活疫苗(A19-ΔVirB12株)，商品名康布净，已获得农业农村部颁发的新兽药证书，标志着布病防治取得突破性进展。牛布鲁氏菌病A19-ΔVirB12活疫苗是以A19株为亲本株，缺失布鲁氏菌IV型分泌系统中VirB12基因的基因缺失疫苗。根据其缺失的VirB12基因设计引物，扩增缺失基因的一部分或全部片段，能有效扩增的为布鲁氏菌野毒株，不能扩增的为基因缺失疫苗株，便可有效区分疫苗免疫和野毒感染，在只免疫A19-ΔVirB12活疫苗的养殖场检测出布病野毒感染动物，以控制和净化养殖场中存在的布病野毒，减少布病带来的经济损失，保障人员安全。因此根据A19-ΔVirB12活疫苗缺失的VirB12基因建立快速、特异、适合布病基层防控的鉴别诊断方法对布鲁氏菌病的防控至关重要。

根据动物布鲁氏菌病诊断技术国家标准(GB/T 18646-2018)，可用于布鲁氏菌诊断的技术方法有：虎红平板凝集试验和间接酶联免疫吸附试验，适用于动物布鲁氏菌病的初筛；乳牛全乳环状试验，适用于泌乳母牛布鲁氏菌病的初筛；试管凝集试验、补体结合试验和竞争酶联免疫吸附试验适用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌病的血清学确诊；病原的鉴定和PCR适用于动物布鲁氏菌病的病原学确诊。近年来，基于PCR的病原检测方法研究和应用较为广泛，然而，在实际应用中，还存在一定不足：(1)布鲁氏菌DNA的制备耗时费力，详见国标GB/T 18646-2018“4.13.1”；(2)检测流程复杂需要专业人员操作；(3)存在非特异性扩增和灵敏度低的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法，解决现有技术PCR的病原检测过程中存在的布鲁氏菌DNA的制备耗时费力、检测流程复杂、需要专业人员操作及非特异性扩增和灵敏度低的问题。

本申请根据A19-ΔVirB12活疫苗缺失的VirB12基因实现区分疫苗免疫和野毒感染，实现从生鲜乳中一步扩增目标基因的目的。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒，包括如表1所示的组分：

表1布鲁氏菌病疫苗株与野毒株快速高灵敏鉴别诊断试剂盒组分