[发明专利]一种复制缺陷型耐药流感病毒及其核酸节段重组率检测方法

说明书

本发明涉及一种复制缺陷型耐药流感病毒及其核酸节段重组率检测方法。根据耐药流感病毒株基因组序列，通过分子克隆技术获得12株耐药流感病毒株，评价其对抗流感药物的耐药率。本发明构建了7种耐药株复制缺陷型流感病毒株（DRRIV）；还构建了用于检测流感病毒各节段重组率的可视化标记流感病毒。筛选出效果最好的NA28TAG/H274Y。联合使用小分子NA抑制剂（NAIs）进一步增强了NA28TAG/H274Y对野生型流感病毒的中和效果。小鼠模型中表明NA28TAG/H274Y与奥司他韦对耐药流感病毒产生了联合增效作用。

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种通过密码子重编码技术构建的耐药株复制缺陷性流感病毒、其治疗耐药流感的应用、以及对该病毒不同节段进行重组率检测的方法。

背景技术

甲型流感病毒遗传多样性的一个主要机制是共感染病毒之间完整基因片段的重组。重组是指多个流感病毒在共同感染同一细胞时多个单股负链RNA基因片段的交换，而形成新型子代病毒。重组后的新毒株可能在病毒复制、致病机制和宿主范围等上发生了变化。由于流感病毒基因不断重组，使得季节性流感不断变化，对抗流感病毒的难度也就不断增加。

对抗流感病毒的重要策略之一是抗病毒药物治疗。目前临床批准使用的抗流感药物可以分为三类，即M2离子通道阻断剂，NA抑制剂和病毒聚合酶(RdRps)抑制剂。然而，流感病毒可以通过基因突变引起抗原漂移，回避了抗体介导的抗原中和，使药物与病毒失去结合位点，或者结合作用降低，从而导致了耐药株的出现。在季节性A(H1N1)病毒株中，H274Y-NA突变是最常见的奥司他韦耐药性标记。在季节性H3N2流感病毒株中，E119V突变最常见，可导致高水平的奥司他韦耐药性。有的流感病毒会对多种神经氨酸酶抑制剂产生耐药。

以最为普遍的H274Y突变为例阐述耐药性的分子机制，NA蛋白的天然底物唾液酸可以与NA的活性位点结合(PDB:2BAT)，当274位点发生H到Y变异的时候，由于疏水性的作用，它使奥司他韦与NA蛋白的距离增加。由于奥司他韦同NA蛋白的结合是缓慢结合，但同时由于侧链构象扭曲，使它的结合不稳定，因此它会出现缓慢结合又快速分离。所以此时要让NA抑制剂与NA蛋白相互作用，就需要更高浓度的NA抑制剂，即病毒出现了耐药性。因此，病毒不同基因片段的重组频率高，病毒重组频发率高，病毒易产生耐药性，成为本领域亟待解决的技术问题之一。