[发明专利]一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法

说明书

本发明涉及植物基因工程技术，公开了一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。该筛选方法包括以下步骤：(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；(2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；(3)将实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。本发明通过分析各候选内参基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，有助于在乌饭树基因表达研究中获得可靠的标准化qRT‑PCR数据。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术，具体地，涉及一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。

背景技术

乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)常绿灌木，与蓝莓同属，其小浆果是饮食中酚类物质如黄酮醇和花青素的丰富来源。乌饭树也是一种药用植物，其果实和叶提取物具有镇定催眠、预防癌症等积极作用。

乌饭树的果、叶、根均可入药食用，记载于《开宝本草》、《本草纲目》、《中药大辞典》等中医药典籍，被我国历代本草学家极为推崇。在《中药大辞典》中，乌饭树被记载为具有“益精气、强筋骨、明目止泻”的功效；在唐代《本草拾遗》中就有记载“乌饭树树叶取汁渍米作乌饭，食之健如牛筋；止泻除睡，强筋益气力”。乌饭树中的黑色素含有极为丰富的有效成分，如花青素类、黄酮类、多酚类化合物、绿原酸类、环烯醚萜苷类、单宁类、三菇类、有机酸类、肌醇类和维生素等。随着对乌饭树资源的研究不断深入，其叶和果实中功能性成分的分子验证尤为重要。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是分子验证的重要手段，而qRT-PCR验证最重要的一个环节是内参基因的选择。传统的越橘属所使用的内参基因如actin、β-tubulin等，在乌饭树果实膨大成熟过程中，一般呈上调表达模式，不适合分析果实发育基因的转录水平。现有技术中，关于乌饭树内参基因的鉴定工作还未有相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个所述乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；

(2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以所述内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；

(3)将所述实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。

优选地，步骤(1)中所述乌饭树候选内参基因为肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示。

优选地，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶对应的所述内参基因引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.30所示。