[发明专利]一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法

权利要求书

1.一种乌饭树实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用乌饭树转录组测序数据，挑选N个乌饭树候选内参基因，以挑选的N个所述乌饭树候选内参基因为模板，分别设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对，其中N≥2；

(2)以乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为模板，以所述内参基因引物对为反应引物对，进行实时荧光定量PCR分析；

(3)将所述实时荧光定量PCR得到的数据导入GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和/或内参基因组合。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述乌饭树候选内参基因为肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述肌动蛋白1、肌动蛋白2、肌动蛋白3、肌动蛋白4、肌动蛋白5、核糖体蛋白、泛素结合酶、泛素蛋白基因、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和腺苷酸激酶对应的所述内参基因引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11-SEQ IDNO.30所示。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述设计实时荧光定量PCR的内参基因引物对的过程包括：利用Primer Premier软件提供多个与所述乌饭树候选内参基因合适的备选引物对，将所述备选引物对进行评分和特异性评价，筛选出该乌饭树候选内参基因对应的所述内参基因引物对。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述评分的条件包括：

a、引物的长度在20-24bp之间；

b、引物3’端的5个碱基中含有1-3个G、C，末尾不是A；

c、扩增长度在80-150bp之间；

d、引物序列的GC含量在50％-60％范围内；

e、引物序列自身二聚体和交叉二聚体连续的碱基数少于4个，不连续的少于7个；

f、没有发卡结构的二聚体。

6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述特异性评价通过所述实时荧光定量PCR的溶解曲线进行评价。

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，以1μg所述乌饭树组织的RNA反转录获得的cDNA为基准，所述内参基因引物对中的每条引物的用量为0.1×10^-3-1×10^-3μmol。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：90-100℃预变10-20min；90-100℃解链5-15s，55-65℃退火25-35s，反应35-45个循环。

9.根据权利要求1至6中任意一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乌饭树组织选自乌饭树果实、乌饭树叶片和乌饭树嫩根中的至少一种。