[发明专利]肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法

说明书

本发明涉及医学体外诊断领域，特别涉及一种肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法。该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，R1试剂包含发色底物、肝素水解酶、赖氨酸、TritonX‑100、第一缓冲剂；R2试剂包含FⅩa、精氨酸、NP‑40、氯化镁、第二缓冲剂。本发明试剂盒一定程度下解决血浆的来源，更符合中国国情，同时制备方便，操作简便，具有较高的灵敏度、稳定性和抗干扰能力，检测结果精确度高，市场竞争优势强。

技术领域

本发明涉及医学体外诊断领域，特别涉及一种肝素测定试剂盒和非诊断目的的肝素含量测定方法。

背景技术

肝素是一种酸性黏多糖，由分布在肠黏膜的肥大细胞合成。正常人血液中含量极少，生理情况下其抗凝作用很小。它可通过加速抗凝血酶、HCⅡ起抗凝作用，对TFPI和蛋白C系统也有影响。天然肝素是不均一的，其分子量在3-57kD之间(王振义.血栓与止血基础理论与临床[M].第三版.上海：上海科学基础出版社，2004:119-119)。临床上把它作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术上、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。

肝素是临床医学中一种最常用的抗凝治疗剂，肝素类药物在抗血栓药物中占有极大的市场份额，其中又以低分子肝素类药物占主导。作为药物，肝素活性功能的精确检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。肝素测定方法主要为凝固法和发色底物法(US4234682、US 4948724、US 5308755 A、CN104048931A、CN 103063592A、CN103323416A；Ten C H,Lamping R J,Henny C P,et al.Automatedamidolytic method for determining heparin,a heparinoid,and a low-Mr heparinfragment,based on their anti-Xa activity[J].Clinical Chemistry,1984,30(6):860-864)。发色底物法是利用肝素糖链中含有与抗凝血酶高亲和的五糖结构域，能够特异性结合体内AT，形成肝素-抗凝血酶复合物，肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子Ⅹ(或凝血因子Ⅱ)水解发色底物的显色反应的基本原理，具有灵敏度高、操作简便、特异性强的特点。肝素的抗血栓活性与抗凝活性与肝素分子中特征组成和相对质量有关，研究显示在抗Ⅹa因子相互作用过程中，只需含肝素核心五糖结构域糖链激活AT进而达到抗凝血的目的；在抗Ⅱa因子相互作用过程中不仅需要肝素包含有核心五糖结构域，还要包括至少十八个单糖组成的糖链(Lane D A,Denton J,Flynn A M,et al.Anticoagulantactivities of heparin oligosaccharides and their neutralization by plateletfactor4.[J].Biochemical Journal,1984,218(3):725-732)。

市面上采用发色底物法的肝素测定试剂盒亦分成两种，一种是两步法，该法包含额外添加的抗凝血酶(AT)，不依赖于样本血浆中的AT含量，检测样品血浆中总肝素含量。另外一种是一步法，该法依赖样本血浆中的AT含量(血浆中AT含量在35％～130％范围)，检测是基于竞争抑制原理，检测样品血浆中起抗凝作用的肝素，如IL公司的LiquidHeparin-0020300100，Aniara Biophen HeparinLRT、STAGO公司的-LiquidAnti-Xa。显而易见，市面上肝素检测常用的一步法试剂盒基本为液体试剂，这使得其稳定性在某种程度上是有限的。

分析目前市售肝素检测试剂盒的应用情况发现：