[发明专利]基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法

说明书

本发明公开了基于固相捕获靶标，结合滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法。所述检测方法通过将待测分析样本与至少一种固体支持物相连，然后将靶标特异性结合组合物与待测分析样本中的靶标相连，该靶标特异性结合组合物包含有寡核苷酸，以该寡核苷酸为引物介导环状核酸分子的滚环复制得到球状滚环复制产物，通过对滚环复制产物的量化分析从而实现对分析物的定量检测。本发明还涉及显微成像检测和流式细胞术对样本进行定量分析。

技术领域

本发明属于分析物鉴定与量化检测的领域，具体涉及基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法。

背景技术

据世界卫生组织最新数据表明，2020年中国平均每分钟有8人被确诊癌症，并且该组织指出，约1/3的癌症可以通过早期诊断发现，从而能及时利用特定的医疗措施延长患者生命、减轻癌症痛苦，甚至治愈疾病。例如，在医学界被称为“癌症之王”的胰腺癌是一种恶性程度很高的消化道肿瘤，大部分胰腺癌患者被确诊时已经伴有至少一处远端转移，并且已不适合开展治愈性手术切除，而对于进展期的胰腺癌患者仍然缺乏行之有效的治疗方式，预后较差。因此，癌症的早期筛查及诊断对于提高癌症治愈率、延长患者生命、提高患者生存质量、改善疾病预后状态均具有非常重要的临床意义。

近几年，外泌体因其在指示癌症病理信息方面的重要作用而受到特别关注，正逐渐成为肿瘤早期诊断和预后的生物标志物之一。外泌体是30～150nm的细胞外囊泡，由正常细胞、肿瘤细胞等主动分泌到体液中。大量的证据表明，肿瘤细胞比正常细胞分泌更多的外泌体，它们携带肿瘤特异性的蛋白质和核酸，并可将这些分子运送到远端受体细胞，重新编程受体细胞以促进肿瘤生长和转移、血管生成等。因此，肿瘤来源外泌体数量水平具有作为液体活检对象的潜力，可为肿瘤早期筛查、治疗反应监测和预后提供评估信息。鉴于外泌体在肿瘤研究中的价值，它促使研究者寻找一种快速有效的肿瘤来源外泌体定量检测方法。蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)等传统的生物学方法已经被用于外泌体的相对定量，但是这些方法需要批量的样本，灵敏度低，不适合肿瘤早期诊断中外泌体含量很低的样本检测。Nanosight主导的纳米粒子追踪分析(NTA)技术也逐渐应用到外泌体定量，但这种方法难以应用于区分不同来源的外泌体或其它类型的粒子，尤其是蛋白质聚集体，只能作为辅助分析技术。此外，流式细胞术是常用的粒子分析技术，具有样本高通量分析优势，但是难以直接分析尺寸只有几十到上百纳米的外泌体。因此，以上技术的这些缺点限制了它们在临床诊断中的应用。目前，尚需要开发能够用于如肿瘤来源外泌体等诊断标志物鉴定与量化的方法，尤其是外泌体绝对定量的技术方法。

发明内容

发明目的：本发明将提供一种用于鉴别检测感兴趣分析物，尤其是对分析物(如外泌体)进行绝对定量的方法。该方法通过检测待分析物上特异性表达的生物分子靶标如蛋白质，实现不同细胞来源分析物如外泌体的种类鉴别，并通过在待分析物上进行靶标特异性的核酸扩增形成的DNA纳米球及其对应的点状信号分析，实现待分析物的高灵敏度检测及绝对定量。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于固相捕获和滚环扩增放大靶标信号的定量检测方法，所述定量检测方法通过将待测分析样本与至少一种固体支持物相连，然后将靶标特异性结合组合物与待测分析样本中的靶标相连，该靶标特异性结合组合物包含有寡核苷酸，以该寡核苷酸为引物介导环状核酸分子的滚环复制得到球状滚环复制产物，通过对滚环复制产物的量化分析从而实现对分析物的定量检测。

其中，所述待测分析样本包括细胞或细胞分泌物，所述细胞包括循环肿瘤细胞，所述细胞分泌物包括外泌体，所述固体支持物包括微球、微粒、成型的聚合物、薄膜、玻璃制品或金属制品或它们的组合。

其中，所述靶标包括DNA、RNA、蛋白质、多肽或蛋白多糖。

其中，所述靶标特异性结合组合物是非共价或共价偶联或连接到寡核苷酸的特异性结合分子，所述特异性结合分子是一种抗体、抗体片段，一种适体，一种寡核苷酸或一种小分子，并且具有靶标结合特异性。