[发明专利]一种组织类器官的制备方法

说明书

本发明提供了一种组织类器官的制备方法，该制备方法包括以下步骤：步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水；步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水；步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水置于37℃恒温培养箱中预培养1‑3天，获得预培养生物墨水；步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块；步骤5、将3D打印块在室温下进行交联，再放置于培养箱中培养，即得组织类器官；本发明通过调整生物墨水比例与细胞浓度并进行预培养，形成初步细胞微球并进行打印，为含细胞3D生物打印中，形成功能性及异质性类器官提供了良好的方法。

技术领域

本发明涉及医疗模型制造及应用领域，特别涉及一种组织类器官的制备方法。

背景技术

当前，用于治疗软组织器官损伤，退行性病变等疾病，最常见的方法是使用自体或者异体器官移植。器官移植最大的局限性在于，供体器官数量非常有限，即使是自体组织细胞移植，在大面积组织损伤(例如大面积深度皮肤烧伤，多处肌腱损伤，大血管缺损等)时，也无法提供足够的移植器官。

近年来，随着生物材料和机械技术的进步与更新，含细胞3D生物打印技术已经成为领域内一个热门话题与技术，基于多种生物材料具有温度，压力或者紫外线响应效果，种子细胞可以在打印前，与液态的生物材料混合，通过3D生物打印机，打印出理想的三维立体结构，在构建体外器官促进组织再生方面具有巨大潜力。

目前生物3D打印技术在临床的应用主要为通过打印模型辅助手术、打印支架诱导细胞分化或者促进组织修复等，在构建器官方面一直是近年来再生领域需要攻克的重点和难点。挤压式打印难以达到构建器官需要的精度，但是可以多种细胞混合，形成组织异质性；立体光刻打印可以形成精微的结构，但是不能将多种细胞混合在一起，具有单一性的限制；但是这两种打印方式都难以达到组织中高密度的细胞结构以及形成特定的功能，这对于3D生物打印技术而言，是其在未来应用和后期推广的一大障碍。

预先在体外形成具有一定组织特异性及细胞密度的细胞微球并用于生物3D打印是解决这一问题的重要方法，目前细胞微球形成的方式有悬滴培养及U型底细胞培养板培养等方法，其形成过程需要时间长且用于打印的过程中需要复杂精细的仪器辅助，成本太高，不适于临床推广普及。

发明内容

为了解决传统生物打印细胞密度低、功能性不完全，以及目前微球打印需要精密仪器、耗时长等问题，本发明的目的是提供一种组织类器官的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

步骤1、采用细胞外基质构建生物墨水；

步骤2、向步骤1获得的生物墨水中加入细胞悬液，获得含有细胞悬液的生物墨水；

步骤3、将步骤2获得的含有细胞悬液的生物墨水置于37℃恒温培养箱中预培养1-3天，获得预培养生物墨水；

步骤4、将预培养生物墨水转移至3D生物打印机进行打印，获得3D打印块；

步骤5、将3D打印块在室温下进行交联，再放置于培养箱中培养，即得组织类器官；

所述细胞外基质包含海藻酸钠、A型明胶、B型明胶、甲基丙烯酸化水凝胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、琼脂糖以及合成性生物材料PLGA及其修饰物中的任意一种或多种。

进一步地，步骤1所述生物墨水包括浓度为1％-4％的海藻酸钠溶液和浓度为3％-5％的明胶溶液。

进一步地，生物墨水的制备方法如下：将海藻酸钠粉末使用去离子水配制成海藻酸钠溶液，将明胶粉末使用去离子水配制成明胶溶液，储存于4℃冰箱待用。

进一步地，步骤2所述细胞悬液由组织固有细胞或具有增殖分化作用的干细胞以及具有旁分泌、分泌囊泡和释放外泌体功能的干细胞制得。