[发明专利]供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，公开了供者特异性IL‑21和IFN‑γ的检测方法，包括提取供者PBMC和受者PBMC并冻存、检测供者特异性IL‑21、检测供者特异性IFN‑γ；还公开了应用。本发明基于ELISPOT和相关细胞因子检测试剂，分离提纯器官移植供者和受者外周血单个核细胞，辐照灭活供者细胞，使其不能产生细胞因子，但保留其抗原性，本发明可实现分泌供者特异性细胞因子的受者细胞的检测，通过本发明可检测器官移植术后供者抗原刺激活化的受者IL‑21或IFN‑γ分泌细胞，可用于评估器官移植受者术前和术后免疫系统的致敏程度，预测肾移植术后急性和慢性排斥反应的发生，动态监测有助于免疫抑制剂个体化用药调整。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用。

背景技术

随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时常用酶联免疫吸附法(ELISA)检测体液中游离的细胞因子(CK)或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)。因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索疾病发病机制，用于疾病的诊断和疗效判断具有重要意义。ELISPOT目前最常用于病毒特异性细胞和细胞因子的检测，但是在器官移植领域的应用相对较少，并且还未见供者抗原刺激受者细胞产生细胞因子的相关检测方案。因此，发明人发明供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用。

发明内容

基于以上问题，本发明提供供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用。

为解决以上技术问题，本发明提供了供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法，包括如下步骤：

S1：提取供者PBMC和受者PBMC，并冻存；

S2：检测供者特异性IL-21

(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20min，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x10⁶/mL；

(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：

A：100μl 3x10⁵受者细胞+100μl细胞培养液

B：100μl 3x10⁵受者细胞+100μl3x10⁵灭活的供者细胞

C：100μl 3x10⁵受者细胞+100μl3x10⁵3^rdparty灭活的供者细胞

D：100μl 1x10⁵受者细胞+100μl ICE 10x

E：100μl 5x10⁴受者细胞+100μl SEB 100ng/mL

F：100μl 5x10⁴受者细胞+100μl PHA5μg/mL

G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞

H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞

于37℃、5％CO₂条件下孵育44小时；