[发明专利]供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法及应用

权利要求书

1.供者特异性IL-21和IFN-γ的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：提取供者PBMC和受者PBMC，并冻存；

S2：检测供者特异性IL-21

(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20分钟，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x10⁶/mL；

(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：

A：100μl3x10⁵受者细胞+100μl细胞培养液

B：100μl3x10⁵受者细胞+100μl3x10⁵灭活的供者细胞

C：100μl3x10⁵受者细胞+100μl3x10⁵3^rdparty灭活的供者细胞

D：100μl1x10⁵受者细胞+100μlICE10x

E：100μl5x10⁴受者细胞+100μlSEB100ng/mL

F：100μl5x10⁴受者细胞+100μlPHA5μg/mL

G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞

H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞

于37℃、5％CO₂条件下孵育44小时；

(3)稀释生物素标记检测抗体：9mLPBS-I+1mL10x稀释缓冲液+100μl生物素标记检测抗体；250μlPBS-I洗涤5次；加入100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS-I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；室温孵育1小时，封闭；PBS-I双面洗板5次，加入100μlAEC底物液，室温避光孵育30分钟，洗板，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数；

S3：检测IFN-γ

(1)对反应板进行包被和封闭处理，复融步骤S1中的供者PBMC和受者PBMC，并对细胞进行如下计数处理：加3mL细胞培养液，用台盼蓝染色后，显微镜下计数；辐射40Gy灭活供者细胞20分钟，辐射后于2000rpm条件下离心5min，再用细胞培养液矫正供者或受者细胞终浓度至3x10⁶/mL；

(2)细胞孵育：在(1)的反应板中加入刺激剂、供者或受者细胞悬液，具体如下：

A：100μl3x10⁵受者细胞+100μl细胞培养液

B：100μl3x10⁵受者细胞+100μl3x10⁵灭活的供者细胞

C：100μl3x10⁵受者细胞+100μl3x10⁵3^rdparty灭活的供者细胞

D：100μl5x10⁴受者细胞+100μlICE10x

E：100μl2.5x10⁴受者细胞+100μlSEB100ng/mL

F：100μl2.5x10⁴受者细胞+100μlPHA5μg/mL

G：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞

H：100μl细胞培养液+100μl灭活的供者细胞

于37℃、5％CO₂条件下孵育20小时；

(3)稀释生物素标记检测抗体：9mLPBS-I+1mL稀释缓冲液10x+100μl生物素标记检测抗体；250μlPBS-I洗涤2次，250μlPBS-Tween洗涤5次；加100μl稀释后的生物素标记检测抗体，室温孵育2小时；PBS-I双面洗板5次；稀释辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，加入100μl稀释后的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育2小时，封闭；PBS-Tween双面洗板5次；加入100μlAEC底物液，室温避光孵育25分钟；去离子水冲洗5次，待反应板自然干燥后，用bioreader计数斑点个数。