[发明专利]基于滚环扩增的测序文库构建方法及其应用

说明书

本申请提供了一种基于滚环扩增的测序文库的构建方法及其应用。该测序文库的构建方法包括：提供闭合环状的双链DNA、cDNA或RNA分子；利用特异性引物，进行滚环扩增，从而每个环仅扩增得到一条含多拷贝的单链DNA产物作为第一链；以第一链为模版，产生互补的第二链，从而获得双链DNA产物。还提供了测序方法及试剂盒。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，更具体涉及一种基于滚环扩增的测序文库的构建方法及其应用、测序方法和试剂盒。

背景技术

单分子测序(SMS)方法作为第三代测序技术，例如Oxford NanoporeTechnologies(ONT)的纳米孔测序技术和Pacific Biosciences(PacBio)的SMRT(singlemolecule real time sequencing，单分子实时测序)测序技术，最大的特点是能够对单分子进行测序，同时具有通量高、读长(read)长、速度快的特点。长读长可以减少拼接成本，节省内存和计算时间。同时，三代测序还拓展了二代测序技术的应用，如直接读取DNA/RNA的甲基化信息。

然而与第三代测序技术的单分子测序相伴随的是其碱基读取错误率偏高，限制了在小片段插入或缺失(InDel)以及单核苷酸变异(SNV)等方面的研究。特别是对于一些序列高度多样性尤其是单个或几个碱基的差异的多样性的核酸序列进行分类时，例如免疫组库的克隆型(clonotype)分型、微生物16s扩增子测序的菌种鉴别，三代测序往往难以达到二代测序的精确度。

PacBio测序平台通过环形测序生成的一系列亚读长(subread)来进行自我校正，从而获得高质量的HiFi读长。这不仅提供了准确的序列信息，在后续的运算方面，分析的流程更为简单，消耗的时间也大大减少。但是其面临读长有限(相较于ONT)、成本高昂的问题。

ONT的纳米孔测序平台是根据不同碱基通过纳米孔时，造成电流幅度变化不同进行碱基识别的。ONT(～100kb)的读长比PacBio(～10Kb)长得多，数据可实时读取且通量更高、测序仪器便于携带，但是其碱基读取的错误率更高。

免疫组库是指在个体的循环系统内，任何指定时间所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。T细胞和B细胞表面有能特异性结合某种抗原的受体，称为T细胞和B细胞表面受体(TCR/BCR，T/B cell recepter)。TCR/BCR上存在一块区域叫互补决定区(ComplementaryDetermining Region,CDR)，包含CDR1、CDR2、CDR3，其中CDR3最高变，在抗原识别中起关键作用。免疫组库具有高度多样性，存在成千上万个克隆型，且有些克隆型仅存在一个拷贝。目前三代单分子测序的高错误率，导致其不能用于免疫组库研究。实际上，目前免疫组库的研究仅限于利用二代测序技术，例如illumina。然而，由于二代测序平台读长短，目前成熟的建库和分析方法大多仅研究CDR3区域，从而失去了全长RNA转录本的信息；同时，由于V、D、J基因片段本身具有多样性，使用二代测序要使用众多引物(例如EuroClonality-NGS工作组提供的IG/TR DNA扩增子测定方法使用了108条引物)；另外，还存在PCR反应多所导致的扩增高偏好性和繁杂费时、难以确定各PCR反应管产物的正确混样比例等问题。考虑到一代测序技术读长能达到大约1000bp，早期将其用于免疫组库的研究，其基于L至C基因片段测序，能够获得RNA全长转录本的信息，但是一代测序技术通量低，且L基因片段引物特异性低、亲和力低，实际很难获得丰富的全长信息。这些都极大限制了免疫组库的更全面研究。

染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNAs,eccDNAs)是指位于染色体外的单链或双链闭合环状DNA，长度分布广泛，几百bp～几百兆bp。eccDNA广泛存在于各种真核生物中，具有很高的组织和疾病特异性。近年来大多数研究表明eccDNA是驱动肿瘤异质性的重要机制，同时eccDNA可以影响细胞生命活动，促进肿瘤细胞演进和适应性进化，增加了基因组的可塑性和不稳定性。