[发明专利]基于滚环扩增的测序文库构建方法及其应用

权利要求书

1.一种用于单分子测序的测序文库的构建方法，其包括：

提供待测序分子的闭合环状的双链DNA分子、cDNA分子或RNA分子形式；

利用特异于所述闭合环状的双链DNA分子、cDNA分子或RNA分子的引物，进行滚环扩增，从而每个环仅扩增得到一条含多拷贝的单链DNA产物作为第一链；

以第一链为模版，产生互补的第二链，从而获得双链DNA产物，作为用于单分子测序的测序文库。

2.如权利要求1所述的构建方法，其中，所述闭合环状的双链DNA或cDNA分子为染色体外环状DNA，或者通过以下方法形成：

A)由平末端的双链DNA或cDNA分子通过连接酶连接成闭合环，例如T4 DNA连接酶、T4RNA连接酶；

B)由粘性末端的双链DNA通过TA连接成闭合环，例如使用3‘端带dT粘性末端的T桥联片段，例如由SEQ ID NO：8和9组成的双链的T桥联片段。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其中，所述滚环扩增使用phi29 DNA聚合酶、BstDNA聚合酶或Klenow酶。

4.如权利要求1至3任一项所述的构建方法，其中，所述cDNA由白细胞的总RNA逆转录而获得，其中滚环扩增所使用的所述特异性引物为SEQ ID NO：22和31-39。

5.如权利要求4所述的构建方法，在提供闭合环状的双链DNA或cDNA分子形式之前，将逆转录所得的cDNA的3’端连接序列为SEQ ID NO：6的单链DNA接头，并使用SEQ ID NO：7、21、23-30的引物进行多重扩增。

6.如权利要求1至5任一项所述的构建方法，其中，所述双链DNA通过使用T桥联片段成环时，所述特异性引物的序列为SEQ ID NO：20。

7.如权利要求1至6任一项所述的构建方法，其中，在所述滚环扩增使用phi29 DNA聚合酶，且所述特异性引物不存在末端修饰。

8.如权利要求1至7任一项所述的构建方法，其中，第一链的互补性第二链通过以下方法产生：

使用末端转移酶在第一链的3'端产生poly-A序列；

使用与第一链的poly-A序列互补的Oligod(T)₂₀作为引物，利用DNA聚合酶产生第二链。

9.如权利要求8所述的构建方法，其中，所述DNA聚合酶是phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或Klenow酶。

10.如权利要求1至9任一项所述的构建方法，还包括将双链DNA产物连接测序接头，以获得所述测序文库。

11.如权利要求10所述的构建方法，利用ONT平台针对双链DNA的连接测序试剂盒连接测序接头。

12.如权利要求1所述的构建方法，其中所述测序文库用于单分子测序，例如纳米孔平台测序如ONT平台或者其他单分子实时测序平台如PacBio平台测序。

13.一种测序方法，其包括：

利用权利要求1-12任一项的构建方法，获得测序文库；

利用单分子测序方法，例如纳米孔平台测序如ONT平台或者其他单分子实时测序平台如PacBio平台测序，对所述文库进行测序。

14.如权利要求1-12所述的构建方法、权利要求13所述的测序方法，用于免疫组库测序、扩增子测序、染色体外环状DNA测序、环状RNA测序。