[发明专利]一种新Cas9蛋白、CRISPR-Cas9基因组定向编辑载体及基因组编辑方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新的Cas9蛋白、CRISPR‑Cas9基因组定向编辑载体和基因组编辑方法。本发明要解决的技术问题是目前已经开发的CRISPR‑Cas系统仍然较少。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种新的Cas9核酸酶蛋白，其具有识别5’‑NGAAA‑3’PAM位点的能力。可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向修饰，甚至可以实现针对基因组中的多样位置(特别是非编码序列)实现基因组编辑、定向修饰及表达调控，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新的Cas9蛋白，其识别5’-NGAAA-3’PAM位点，以及CRISPR-Cas9基因组定向编辑载体和基因组编辑方法。

背景介绍

植物特定性状相关基因的功能鉴定及育种应用一定程度上依赖于可靠突变体种质材料的获得，而目前突变体种质材料主要基于自然突变体的收集、及物理化学因素诱变策略获得。同时，上述突变体创制所造成的基因突变随机，难以针对特异基因定向突变，这对生物育种、基因功能研究及物种从头驯化来说都是巨大掣肘。随着分子操作技术的发展，以ZFN、TALEN及CRISPR-Cas为代表的基因组编辑技术已在突变体种质材料创新中得到有效应用。其中，CRISPR-Cas系统以其结构简单、编辑效率高、可拓展性强的特点，后来居上，迅速成为应用最为广泛的基因组编辑技术。

最为常用的Cas9系统主要是来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9系统，其主要识别的PAM位点为5’-NGG-3’。SpCas9系统对富A/T区域的编辑比较有限，可选择位点较少，极大地影响了实际应用。目前已经开发的CRISPR-Cas系统相较于庞大的CRISPR-Cas成员库仍显得比较局限，具有优良编辑性能的新成员仍有待挖掘。因此，寻找新的Cas系统并用于基因组编辑具有十分重要的意义，也是我国生物技术产业化发展的重大战略需求。在丰富的原核生物基因组库中寻找自然进化的高特异性、高编辑活性、无差别PAM识别的新CRISPR-Cas系统，并且进行从头开发、探究其作为基因组编辑工具的可能性是本领域目前急需进行但又充满挑战的工作。

发明内容

本发明要解决的技术问题是目前已经开发的CRISPR-Cas系统仍然较少。本发明解决上述技术问题的技术手段是提供了一种新的Cas9核酸酶蛋白。该Cas9蛋白为：

(a)其氨基酸序列为SeqID No.1所示；或者：

(b)氨基酸序列为与SeqID No.1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加，具有相同或相似生物学功能。

进一步的，上述的Cas9蛋白所述的具有相同或相似生物学功能是指具有以下至少一种活性：

与导向RNA结合的活性、在导向RNA引导下与靶序列特定位点结合的活性、核酸内切酶活性、在导向RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割核酸的活性或识别PAM位点；进一步的，所述PAM位点的特征为5’-NGAAA-3’,N表示A、G、C、T中的任一种。

进一步的，上述的Cas9蛋白，其氨基酸序列为在SEQ ID No.1进行了D13A突变和/或H858A突变得到的序列。

本发明还提供了上述的Cas9蛋白的编码基因。

进一步的，上述的Cas9蛋白的编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

D13A突变将该位置核苷酸由GAT变为GCT，H858A突变将该位置核苷酸由CAT变为GCT。

本发明还提供了含有上述的编码基因的表达载体。

其中，上述的表达载体含有Cas9蛋白表达单元，结构为ZmUbi1-LacCas9-NLS-AtHSP。