[发明专利]一种新Cas9蛋白、CRISPR-Cas9基因组定向编辑载体及基因组编辑方法

权利要求书

1.Cas9蛋白，其特征在于： 其氨基酸序列为在SEQ ID No.1中进行了D13A单突变或者D13A/ H858A双突变得到的序列。

2.权利要求1所述的Cas9蛋白的编码基因。

3.含有权利要求2所述的编码基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于含有Cas9蛋白表达单元，结构为ZmUbi1-LacCas9-NLS-AtHSP，所述的LacCas9组件为权利要求2所述的编码基因；所述ZmUbi1为玉米Ubi1启动子，所述的NLS为核定位序列，所述的AtHSP为拟南芥HSP终止子。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于还含有sgRNA克隆及转录单元，可共表达权利要求1所述的Cas9蛋白和sgRNA

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述sgRNA克隆及转录单元的结构为OsU6-ccdB-sgRNA scaffold-TTTTTT；所述的OsU6为水稻OsU6启动子；所述的sgRNAscaffold为sgRNA骨架；所述的ccdB为大肠杆菌致死基因；所述的TTTTTT为sgRNA转录终止信号。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述的sgRNA克隆及转录单元的sgRNAscaffold组件的核苷酸序列为Seq ID No.3中6477-7512所示、Seq ID No.4所示或Seq IDNo.5所示。

8.权利要求3～7任一项所述的表达载体在构建CRISPR-Cas9基因编辑系统中的用途。

9.CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于：使用3～7任一项所述的表达载体为CRISPR-Cas9基因编辑系统提供Cas9蛋白活性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、骨架载体构建：构建权利要求3～7任一项所述的表达载体作为CRISPR-Cas9骨架载体；

b、定向基因编辑载体构建：针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA，合成sgRNA的引物对，将引物对退火形成带粘性末端的双链DNA，将双链DNA替换CRISPR-Cas9骨架载体中的ccdB元件，获得定向编辑表达载体；

c、定向基因编辑：

使用步骤b得到定向编辑表达载体转化待编辑细胞，获得定向基因编辑的细胞或植株；

或者；

使用步骤b得到定向编辑表达载体转化原生质体，检测原生质体的基因定向编辑情况，将成功定向编辑的原生质体培养得到定向基因编辑植株；

或者；

使用步骤b得到定向编辑表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入目标植物，获得定向基因编辑植株。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤b按以下具体步骤进行：

a）、明确待编辑的植物基因组的目标DNA区域，分析其中的具有权利要求1所述的Cas9蛋白能识别的PAM位点特征区域，选择PAM结构3’端相邻的20bpDNA序列作为特异性修饰靶序列；所述的PAM位点特征为5’-NGAAA-3’,N表示A、G、C、T中的任一种；

b）、按照选定的特异性修饰靶序列，分别合成具有5’-GTGTG-NX-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AGAC-NX-3’特征的反向寡核苷酸链，N表示A、G、C、T中的任一种，X为整数，且当所选靶序列第一位为G时，X=19；当所选靶序列第一位不为G时，X=20，其中所述正向寡核苷酸链中的NX和反向寡核苷酸中的NX具有反向互补特征；通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；

c)、将双链DNA替换CRISPR-Cas9骨架载体中的ccdB元件，获得定向编辑表达载体。