[发明专利]Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法

说明书

本发明公开了一种pUC57kan‑T7重组质粒的构建法，包括以下步骤：根据小鼠miR‑379/410基因簇两端的序列，针对基因簇的两端设计gRNA；引物退火形成的双链克隆入pUC57kan‑T7载体，得到pUC57kan‑T7重组质粒。本发明还同时公开了利用CRISPR技术构建miR‑379/410基因簇条件性敲除模型的方法：将pUC57kan‑T7重组质粒进行体外转录，获得sgRNA；基于PMD‑18T质粒，构建包含5’端同源臂的donor重组质粒；基于PMD‑18T质粒，构建包含3’端同源臂的donor重组质粒；构建miR‑379/410CKO。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及应用CRISPR/Cas9技术建立Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法。

背景技术

小鼠12号染色体上存在着Dlk1/Dio3印记区域，该印记区域跨度为830kb，包括3个编码蛋白的父系表达基因(Dlk1，Rtl1和Dio3)以及若干母系表达的非编码RNA(包括Dio3、Rian、Mirg、anti-Rtl1、Irm、Meg8)。Mirg主要分为两个主要区域，分别是源自Rtl1转录本的miR-127/miR-136簇和miR-379/410簇。其中，miR-379/410簇是胎盘哺乳动物中已知最大的miRNA簇，并且在脊椎动物中保守，然而miR-379/410簇的功能尚不明确，值得进一步研究。构建基因敲除动物模型是研究Dlk1-Dio3印记区域生物学功能过程中急需解决的问题。

目前有关miR-379/410簇的功能报道的比较少，仅有2篇文献，都是基于MiR-379/miR-410簇全身敲除的小鼠。其中一篇研究显示：MiR-379/miR-410簇敲除的小鼠大脑兴奋性突触传递增加以及海马中离子型谷氨酸受体复合物过度表达，小鼠的社交行为被过度激活。另有1篇文章研究，miR-379/410簇基因敲除的部分新生儿小鼠由于肝脏内大量代谢基因的表达失调引起了脂质代谢和葡萄糖代谢的异常，从而在出生后不久就死亡了，提示miR-379/410簇的全身敲除有一定的致死性风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种应用CRISPR/Cas9技术建立Mir-379/410基因簇条件性敲除小鼠模型及其构建方法。

为实现上述目的，本发明提供一种pUC57kan-T7重组质粒的构建法，包括以下步骤：

①、根据小鼠miR-379/410基因簇两端的序列，针对基因簇的两端设计gRNA，5’端设计的gRNA为gRNA1和gRNA2；3’端设计的gRNA为gRNA3和gRNA4：

gRNA 1:TGAGGCTTGGCCCTATTGCA GGG

gRNA 2:GAGGCCCAGTCCCTGCAATA GGG

gRNA 3:CCACTCCGTGAACGTCTCCG TGG

gRNA 4:CCACGGAGACGTTCACGGAG TGG

②、引物退火(gRNA1和gRNA2退火，gRNA3和gRNA4退火)形成的双链克隆入pUC57kan-T7载体，得到pUC57kan-T7重组质粒。

本发明还同时提供了一种利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，包括以下步骤：

1)、将pUC57kan-T7重组质粒进行体外转录，获得sgRNA；

2)、基于PMD-18T质粒，构建包含5’端同源臂的donor重组质粒；

3)、基于PMD-18T质粒，构建包含3’端同源臂的donor重组质粒；

4)、构建miR-379/410 CKO。