[发明专利]Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法

权利要求书

1.pUC57kan-T7重组质粒的构建法，其特征在于包括以下步骤：

①、根据小鼠miR-379/410基因簇两端的序列，针对基因簇的两端设计gRNA，5’端设计的gRNA为gRNA1和gRNA2；3’端设计的gRNA为gRNA3和gRNA4：

gRNA 1:TGAGGCTTGGCCCTATTGCA GGG

gRNA 2:GAGGCCCAGTCCCTGCAATA GGG

gRNA 3:CCACTCCGTGAACGTCTCCG TGG

gRNA 4:CCACGGAGACGTTCACGGAG TGG

②、引物退火形成的双链克隆入pUC57kan-T7载体，得到pUC57kan-T7重组质粒。

2.利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、将pUC57kan-T7重组质粒进行体外转录，获得sgRNA；

2)、基于PMD-18T质粒，构建包含5’端同源臂的donor重组质粒；

3)、基于PMD-18T质粒，构建包含3’端同源臂的donor重组质粒；

4)、构建miR-379/410CKO。

3.根据权利要求2所述的利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于：

所述步骤4)为：利用Cas9蛋白、体外转录获得的sgRNA、5’同源臂Donor、3’同源臂Donor，构建miR-379/410CKO。

4.根据权利要求3所述的利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于，所述步骤2)为：

针对miR-379上游，设计5’arm同源臂引物和3’arm同源臂引物，以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR的方法，从小鼠基因组中扩增出带有lox P的5’arm片段和带有lox P的3’arm片段；然后通过SILAC的方法将5’Donor的5’arm片段、3’arm片段和线性化的pMD-18T片段连接，获得5’donor重组质粒。

5.根据权利要求2～4任一所述的利用CRISPR技术构建miR-379/410基因簇条件性敲除模型的方法，其特征在于：

受体鼠出生的F0代小仔，提取基因组DNA进行PCR和测序鉴定，确认基因型；

当采用引物①进行PCR：当PCR产物为322bp时，为WT小鼠；当PCR产物有414bp和322bp两条带时，此为miR-379/410CKO杂合子小鼠；当PCR产物是单一的414bp时，此为miR-379/410CKO纯合子小鼠；

当采用引物②进行PCR：当PCR扩增不出任何条带时，为WT小鼠；当PCR产物是323bp时，此为miR-379/410CKO杂合子小鼠或者miR-379/410CKO纯合子小鼠。