[发明专利]一种DNA二代测序文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种DNA二代测序文库的构建方法，包括步骤：基因组DNA的酶切、末端修复和加A；DNA片段接头连接；接头连接后产物的磁珠纯化处理；DNA片段PCR扩增、PCR产物片段的选择与纯化处理。本发明提供的DNA二代测序文库构建方法，以双酶切和末端修复一步反应工艺，使用VVN和T7将片段进行片段化处理，再利用Taq DNA聚合酶的聚合作用将5’突出补平，然后再3’加上A(腺嘌呤)，整合一步反应的实现构建DNA二代测序文库，第一步反应结束无需进行磁珠纯化，使得构建工艺简单；该工艺制备中，两种限制性内切酶没有偏好性，可实现目标片段测序。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种DNA二代测序文库的构建方法。

背景技术

基因测序仪是测序产业链的起点，也是关键环节，它为整个中下游测序服务提供最基本的测序支撑，同时也是壁垒最高的部分，处于基因测序产业价值链顶端。

目前主要的测序上游供应商依然以海外为主，各巨头之间的竞争也异常激烈。在1986年Applied Biosystem公司第一台商用自动测序仪的发布吹响了抢占市场份额的号角。1986年至2005年间，测序仪市场竞争相对缓和，基本由ABI公司占领市场，整体市场份额也相对较小，并未完全打开。2005年，454LifeSciences公司推出454GS 20测序仪；2006年，Illumina收购Solexa；2006年，ABI公司推出Solid测序平台。二代测序仪逐步进入市场，迅速抢占市场份额的同时，也进一步提高需求量，扩大整体市场容量。随后的十年间，各大巨头争相并购优秀企业，逐步完善测序技术，产品推陈出新，市场规模被迅速扩大。

二代测序仪具有高通量、低成本、数据稳定可靠等优点，成为测序仪领域的主要贡献者。经过了十年左右的发展成熟，逐渐形成以Illumina公司为领头羊，以Thermo Fisher和Roche为主要玩家的市场格局，近几年，华大基因也推出自主研发的基因测序仪。由于测序仪技术壁垒极高，市场极度集中，这国内测序仪市场主要被以上几家公司占领，其中Illumina公司产品独占鳌头，行业一致认为Illumina占据了全球70－80％的市场份额。

不同的测序平台会在技术细节上有许多不同，但他们都有以下几个共同点：

1、文库建立：所有二代测序的平台都需要一个基因文库，这个基因文库包含通过引申或者连接自定义的接头序列。

2、测序仪器：每个文库片段在共阶吸附的DNA连接因子的作用下，以文库适配序列为模版，在固体表面上进行扩增；这步扩增会产生许多DNA蔟，每个来源于一个文库片段，每个基因蔟都会像独立的测序反应一样起作用。

3、数据输出：每个仪器都会在测序结束后给出原始数据。这个原始数据时每个基因蔟中形成的DNA序列的集合。

制备测序基因文库是最初始的一步，文库就是一个包含你所要测序的所有基因序列的集合体。再将这些片段化后得到的所有短序列的两端加上接头，从而将要测序的序列制备成为一个有很多拥有相同双端序列，但内部序列不同的序列片段集合体。

以illumina平台为例，参阅附图1所示，现有常规建库流程包括如下步骤：

(1)首先将要测序的序列或者基因组等使用物理机械(超声波打断)或者或者是酶学方法处理，即可得到片段化后的DNA序列，每个片段大概200－300bp。

(2)片段化后的序列很大几率是拥有末端凸出的序列，并不是完整的配对状态，因此需要使用酶将其末端补平。

(3)再使用酶在序列的平末端两端各加上一个A(腺嘌呤)尾。

(4)通过上一步加上的A尾，illumina公司制作的接头(adapter)很容易加在序列的两端。

(5)通过上面的步骤，制作步骤就结束了。