[发明专利]一种DNA二代测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种DNA二代测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、基因组DNA的酶切、末端修复和加A：首先，利用两种常见的限制性内切酶对基因组DNA进行双酶切消化，得到酶切片段；接着，利用聚合酶对酶切片段进行末端修复和DNA的3’端加A，得到DNA加A产物；

S2、使用连接酶，将所述DNA加A产物与DNA的5’端带有突出T的接头连接在一起，得到含“接头－DNA插入片段－接头”形式的DNA片段；

S3、通过第一次纯化处理，将所述DNA片段回收，得到目标DNA片段；

S4、以回收的所述DNA片段作为模板进行PCR扩增，以富集所述目标DNA片段，构建并获得DNA二代测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，两种所述限制性内切酶分别是VVN和T7。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述基因组DNA的酶切反应温度为37℃，反应时间为20－30min；所述加A反应温度为65℃，反应时间为20－30min。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述连接酶为T4DNA连接酶。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，所述接头连接的反应温度为20℃，反应时间为20－30min。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述第一次纯化处理包括如下步骤：

S31、所述接头连接反应结束后，将所述DNA片段置于离心管中，加入72μL DNA磁珠，吹打混匀或震荡低速混匀所述DNA片段，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；

S32、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述DNA片段且溶液变澄清之后，吸去离心管中的溶液；

S33、吸取200μL 80v/v％的乙醇于EP管，期间轻轻旋动EP管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；

S34、重复上一步骤S33；

S35、快速离心数s，让离心管管壁液体甩到管底；待磁珠吸附全所述DNA片段后，用枪吸取离心管中的溶液；

S36、室温晾3min，让残留乙醇蒸发；

S37、吸取22μL DNA洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀所述DNA片段，室温反应5min；

S38、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全所述DNA片段且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μL于新的PCR管中得到纯化后的目标DNA片段。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S4中，所述PCR扩增处理包括如下步骤：

S41、往PCR管中加入PCR酶混合液、PCR引物混合液，进行DNA片段的PCR扩增反应，以富集所述目标DNA片段；

S42、待PCR扩增反应结束后，回收PCR扩增产物，对PCR扩增产物的DNA片段进行选择和第二次纯化处理后，得到DNA二代测序文库。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤S41中，所述PCR扩增反应中，根据反应阶段，其反应温度和反应时间如下：

1)预变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为3min；

2)变性阶段：反应温度为95℃时，反应时间为20s；

3)退火阶段：反应温度为58℃时，反应时间为20s；

4)延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为20s；

5)终延伸阶段：反应温度为72℃时，反应时间为5min；

6)保存阶段：反应温度为4℃；

其中；第2)至4)阶段，分别需要执行10－14个循环；第1)和第5)阶段，各执行1次。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，步骤S42中，PCR扩增反应结束后，还包括对DNA片段的选择和第二次纯化步骤如下：

S421、反应结束后，补水至100μL，再加入80μL DNA磁珠，吹打混匀或震荡低速混匀PCR扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min，期间可轻弹离心管管底使磁珠均匀分布；

S422、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全PCR扩增产物且溶液变澄清之后，转移溶液至含有40μL DNA磁珠的低吸附管，吹打混匀或震荡低速混匀PCR扩增产物，低速离心甩掉离心管管壁和盖子上的液滴，使磁珠均匀分散在溶液中，室温反应5min；

S423、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全PCR扩增产物且溶液变澄清之后，弃上清，并加入200μL 80v/v％的乙醇于EP管，期间轻轻旋动EP管两圈，每次半圈，使磁珠在离心管管壁上移动；

S424、重复上一步骤S423；

S425、快速离心数s，让离心管管壁液体甩到管底；待磁珠吸附全所述PCR扩增产物后，用枪吸取离心管中的溶液；

S426、室温晾3min，让残留乙醇蒸发；

S427、吸取22μL DNA洗脱液：从有磁珠一侧加入，将磁珠冲入离心管管底；然后反复吹打或震荡低速将磁珠混匀PCR扩增产物，室温反应5min；

S428、将EP管插入磁力架的管孔里，待磁珠吸附完全PCR扩增产物且溶液变澄清之后，用移液枪吸取20μL于新的EP管中，得到DNA二代测序文库。