[发明专利]一株生产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建与应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用木糖诱导生产N‑乙酰神经氨酸的基因工程菌。以大肠杆菌为出发菌株，在基因组上整合N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径，并引入来自项圈藻的N‑乙酰氨基葡萄糖2‑差向异构酶基因bAGE以及N‑乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，构建N‑乙酰神经氨酸合成途径，并敲除其分解代谢途径的关键基因nanATEK。同时对合成N‑乙酰神经氨酸所需的前体物质的代谢途径进行多拷贝强化并对部分旁路代谢途径进行敲除，通过对产GlcNAc和Neu5Ac的关键酶基因进行不同拷贝数的优化，最终确定了关键酶基因的最佳比例，得到一株N‑乙酰神经氨酸高产菌。N‑乙酰神经氨酸产量最高可达28g/L，生产强度最高可达0.67g/(L×h)，为目前报道的最高值，具有重要的工业应用价值。

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建与应用。

背景技术：

神经氨酸又称唾液酸，是一类含有九个碳原子具有吡喃糖结构的酸性氨基糖。N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid,Neu5Ac)是唾液酸家族中最重要的一员，在生命活动过程中具有重要意义。

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)通常存在于糖脂和糖蛋白的非还原端，在受精、免疫、分化和神经事件中作为配体受体和细胞-细胞相互作用。N-乙酰神经氨酸具有许多重要的功能，包括提高学习记忆能力，促进婴儿骨骼生长，吸收维生素和矿物质，促进大脑和骨骼发育。Neu5Ac可进入胎儿和婴儿的神经系统，与糖磷脂结合形成神经节苷脂，促进婴儿神经系统的发育。Neu5Ac在抗粘连、抗病毒、抗癌等方面具有重要的医学应用价值，是抗病毒药物扎那米韦和奥司他韦的中间体。

目前，Neu5Ac的生产方法主要有天然物质提取、聚合物水解、化学和酶催化、全细胞催化、微生物发酵合成等。与其它方法相比，全细胞催化法不需要额外的ATP，节省了生产成本，但大多数反应仍需添加昂贵且过量的丙酮酸和N-乙酰葡萄糖胺作为底物。在整个细胞催化过程中，底物和产物的转移通常受到细胞膜的阻碍，该方法降低了反应速度和产物收率，N-乙酰葡萄糖胺的产率小于60％。这些问题极大的限制了工业上利用全细胞催化法生产Neu5Ac的发展。

因此微生物发酵法逐渐成为了生产Neu5Ac的热点方向。微生物发酵法利用简单廉价的碳源(如葡萄糖和甘油)直接微生物发酵Neu5Ac，不需要任何直接的前体和辅助因子，具有广阔的应用前景和市场价值。

Tian等人利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为生产菌株，摇瓶发酵得到Neu5Ac产量为9.71g/L。Pang等人利用大肠杆菌(E.coli)作为生产菌株，摇瓶发酵120h得到Neu5Ac产量为14.23g/L，但生产强度仅有0.12g/(L×h)，并且没有发酵规模放大的结果报道。以上产量均为目前报道的不同宿主细胞中的最高产量，但仍然无法满足工业生产需求。

发明内容：

针对上述存在问题，本申请通过构建N-乙酰神经氨酸大肠杆菌生产菌，对大肠杆菌代谢途径进行合理改造，并通过增强主要代谢途径、阻断分解代谢等代谢工程策略，实现了利用廉价碳源葡萄糖高效快速生产Neu5Ac。本发明提供一种利用木糖诱导生产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌，及其构建与应用，并制定了相应的发酵过程控制方案，有良好的工业应用前景。