[发明专利]一株生产N-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建与应用

权利要求书

1.一株生产Neu5Ac的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，具有木糖诱导型启动子P_xylF控制的来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，糖代谢转录抑制因子突变体mlc*基因替换原有mlc基因，敲除了nagA、nagB、nagC、nagE、manX、manY、manZ基因，在基因组上单拷贝氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1，双拷贝果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS，单拷贝磷酸转移酶基因yqaB，单拷贝N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因bAGE，双拷贝N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，敲除Neu5Ac分解代谢相关基因nanATEK，敲除PTS系统相关基因ptsG，整合葡萄糖易化转运蛋白基因glf、葡萄糖激酶基因glk，敲除丙酮酸激酶pykA；

宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)W3110；

T7 RNA聚合酶基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，由P_T7启动子控制；

果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，由P_T7启动子控制；

N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶基因bAGE，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，P_T7启动子控制；

N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，由P_T7启动子控制；

磷酸转移酶基因yqaB，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，由P_trc启动子控制；

葡萄糖易化转运蛋白基因glf，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，由P_trc启动子控制；

葡萄糖激酶基因glk，核苷酸序列核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，由P_trc启动子控制；

糖代谢转录抑制因子突变基因mlc*，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示。

2.权利要求1所述的生产Neu5Ac的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)在lacIZ基因位点上整合由木糖启动子P_xylF控制的T7 RNA聚合酶，引入糖代谢转录抑制因子突变基因mlc*替换原有mlc基因，解除葡萄糖抑制作用；

(2)构建GlcNAc合成通路：敲除GlcNAc的分解代谢途径相关基因：nagA、nagB，nagC、nagE、manX、manY、manZ，同时在nagE基因位点整合由P_T7启动子控制的氨基葡萄糖-6-磷酸N-乙酰转移酶基因Sc-gna1；在假基因位点yjiV和假基因位点ycjV上整合由P_T7启动子控制的果糖-6-磷酸转氨酶基因glmS；

(3)在假基因位点ilvG上整合P_trc控制的磷酸转移酶基因yqaB；

(4)敲除了Neu5Ac的分解代谢途径nanA、nanT、nanE、nanK，并在假基因位点gapC整合由P_T7启动子控制的N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因bAGE，在假基因位点yeep和假基因位点mbhA上分别整合了由P_T7启动子控制的N-乙酰神经氨酸合成酶基因neuB；

(5)加强前体物质磷酸烯醇式丙酮酸的积累：敲除PTS系统相关基因ptsG，在假基因位点rph上整合由P_trc启动子控制glf，在假基因位点ycgh上整合由P_trc启动子控制glk；敲除丙酮酸激酶pykA。

3.权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌在生产Neu5Ac中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，摇瓶发酵生产Neu5Ac的方法如下：将种子液按10-15％接种量接种到发酵培养基中，在35-39℃，180-240r/min的条件下振荡培养，发酵过程中维持pH在6.8-7.2，缺糖时补加葡萄糖溶液，发酵周期为30-36h。